[发明专利]无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及兽用生物制品工程技术领域，更为具体的说是涉及无血清培养及其用途和应用这些培养基的猪瘟病毒的培养方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。目前，我国控制猪瘟疫病的主要手段是接种猪瘟兔化弱毒(HCLV)活疫苗。传统的猪瘟疫苗生产方式是感染兔体，然后收集脾脏及腹腔淋巴制成组织苗，或者是采用原代牛睾丸细胞增殖的细胞苗。但上述两种方式已逐步被连续传代猪睾丸细胞(Swine testis，ST)生产猪瘟疫苗所替代。

对于ST细胞而言，一般采用基础培养基中添加10％的牛血清进行贴壁培养，其方法是在基础培养基中添加2％的牛血清进行猪瘟病毒的增殖。由于猪瘟病毒在ST细胞上不产生细胞病变，所以一般可以允许3～5次接种病毒、收集病毒的操作。

但是在细胞生长及病毒增殖过程中加入的牛血清有几率造成牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其抗体的污染。BVDV与CSFV同属于黄病毒科，瘟病毒属。猪瘟弱毒活疫苗产品中如果残有BVDV的污染可能会造成免疫动物严重的副反应。生产过程中如果有BVDV抗体的存在，则可能导致加入的猪瘟病毒种毒被中和，无法实现病毒的高滴度增殖，从而导致无法获得高滴度疫苗产品。

目前无血清培养基已经有所报道，但是目前现有文献报道的无血清培养基主要针对的是商业应用专属细胞株，或者最为接近的也是针对动物的肾脏组织来源的细胞。

由于不同的细胞，或者病毒所需要的培养条件差异性很大，因此发明人无法直接借鉴现有的无血清培养基组成，必须针对这一问题，重新研究，获得适用于ST细胞培养，以及CSFV增殖的无血清培养基。

发明内容

本发明针对目前ST细胞培养，以及CSFV病毒增殖中适用的无血清培养基的研究空白，公开了一系列分别用于猪睾丸细胞的生长、猪瘟病毒增殖的无血清培养基，并针对全新的培养基提出了一种新的猪瘟病毒培养方法。

首先，本发明公开了第一种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7.0～7.5的水溶液，其组分如下：

MEM基础培养基 9.8g/L；

丙酮酸钠 50～200mg/L；

大豆蛋白水解物 0.1～2g/L；

胆固醇 0.1～6mg/L；

碱性成纤维细胞生长因子 0.5～50mg/L；

抑制素B 0.5～50mg/L；

胰岛素 5～50mg/L；

L-丙氨酸 2～30mg/L；

L-缬氨酸 52～150mg/L；

L-亮氨酸 10～80mg/L；

L-异亮氨酸 5～180mg/L；

L-甲硫氨酸 15～300mg/L；

L-脯氨酸 10～250mg/L；

L-苯丙氨酸 10～250mg/L；

L-色氨酸 5～300mg/L；

L-甘氨酸 0～50mg/L；

L-丝氨酸 5～150mg/L；

L-苏氨酸 5～250mg/L；

L-半胱氨酸 5～250mg/L；

L-天冬酰胺 5～200mg/L；

L-谷氨酰胺 250～400mg/L；

L-酪氨酸 5～250mg/L；

L-天冬氨酸 2～80mg/L；

L-谷氨酸 5～200mg/L；

L-赖氨酸 6～100mg/L；

L-精氨酸 5～300mg/L；

L-组氨酸 5～300mg/L；

羟脯氨酸 0～40mg/L；

豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；

棕榈酸 0.01～0.3mg/L；

棕榈油酸 0.01～0.3mg /L；

硬脂酸 0.01～0.3mg/L；

精胺 0.1～0.3ml/L；

亚精胺 0.1～0.3ml/L；

还原型谷胱甘肽 1～3mg/L；

乙醇胺 1.5～3ml/L；

β-巯基乙醇 0.5～2ml/L；

甘油 0.5～2g/L；

生物素 0.01～0.1mg/L；

吡哆醇 1～5mg/L；

抗坏血酸 0.5～5mg/L；