[发明专利]铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用

权利要求书

1.铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

（1）将铁皮石斛粉加入缓冲溶液PBS中浸泡提取蛋白, 硫酸氨沉淀,透析冷冻干燥，得到蛋白质粉末；

（2）取步骤（1）所得蛋白质粉末溶解于蒸馏水, 配成铁皮石斛蛋白液, 分别加入3种蛋白酶，即碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶, 在控制条件下进行酶解, 得到三种酶解液；

（3）取步骤（2）得到的三种酶解液,再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析，水洗脱，在检测波长280nm下收集得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。

2.根据权利要求1所述铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)称取20-200 g铁皮石斛粉末，用液氮研磨后加入1-4 L的PBS浸泡12-36 h，再用纱布过滤掉残渣得到铁皮石斛的PBS提取液；在PBS提取液中加入硫酸铵至饱和度10%-90%，过夜，在转速为5000-10000 r/min条件下离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用PBS溶解蛋白浸膏后装入截留分子量范围5000-10000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末；

(2)称取1-5g蛋白粉末, 蒸馏水配成质量百分比浓度为1-10%的铁皮石斛蛋白液，分别加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解， 碱性蛋白酶Alcalase 2.4L的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度 (E/S)为2-10%，温度30-60 ℃，pH =6-9，反应时间为6-12 h；胰蛋白酶的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度(E/S)为2-12%，温度25-55 ℃，pH =6-10，反应时间为6-12 h；碱性蛋白酶37017的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度(E/S)为2-12%，温度20-65 ℃，pH=7-10，反应时间为6-13 h；该过程中实时用0.05-0.5 mol/L的NaOH和HCL来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之内，水解后，在90-100 ℃的水浴中灭酶10-30 min，冷却到室温后在5000-10000 r/min下离心5-30 min后取上清液，得到三种酶解液； 

(3)对步骤（2）得到的三种酶解液进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-25分离纯化，具体条件为：柱体积为80-200 mL，上样量为1-5mL，其中含200-600 mg酶解多肽干粉，流动相为水，流速为0.5 mL/min，每6 min收集一管，总共收集100管，检测波长为215 nm和280 nm；碱性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰A1,A2和A3; 胰蛋白酶酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Y1,Y2和Y3; 碱性蛋白酶37017酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰S1,S2和S3. 这样, 三种酶解产物经Sephedax G-25柱层析后共得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。

3.根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛抗肿瘤多肽组分的具体有多肽质量含量为：A1为39.6%，A2为47.2%，A3为99.2%，Y1为33.7%，Y2为54.0%，Y3为58.2%，S1为33.8%，S2为40.6%，S3为86.4%。

4.根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛抗肿瘤多肽组分中A3含有10个肽, MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定其中3个肽的序列分别为: RHPFDGPLLPPGD, KPEEVGGAGDRWTC和RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD。

5.根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛抗肿瘤多肽组分具有抗肿瘤活性；所述组分A3对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的半抑制浓度IC50分别为：169.62 μg/mL、155.20 μg/mL、107.53 μg/mL。

6.权利要求1-5任一一项所述的制备方法制备得到的铁皮石斛抗肿瘤多肽应用于功能食品或抗肿瘤医药的制备。