[发明专利]一种表达α-淀粉酶工程菌的构建及该工程菌在动物饲料中的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和动物饲料科学领域，具体阐述一种表达α-淀粉酶工程菌的构建及该工程菌在动物饲料中的应用。 

背景技术

目前，国外对饲料酵母及酵母培养物(Yeast Culture，YC)已经进行了很深入的研究，但我国开展研究的时间比较迟。近年来，由于国家限制抗生素类产品在动物饲料中使用，所以酵母及酵母培养物已经成为替代抗生素的重要产品之一，其实际生产意义是深远的。酵母菌具有很多生理功能，使其在饲料工业中得到了广泛的研究与应用。在反刍动物上，酵母培养物能保持动物胃肠道微生态平衡；增强动物免疫功能；消除动物体内有毒物质及抗氧化作用；改善动物生长性能。但天然野生的酿酒酵母不含淀粉酶，不能分泌淀粉酶，且反刍动物的消化过程中淀粉得不到充分消化，约会残留5％左右。 

因此，研究携淀粉酶的酿酒酵母作为反刍动物饲料添加剂对瘤胃微生物发酵的影响有着重要的意义。携淀粉酶的酿酒酵母作为反刍动物饲料添加剂，不仅能促进瘤胃微生物发酵、提高生产性能，还能提高饲料中淀粉的利用率。因此，可以通过基因工程的方法把外源淀粉酶基因转入到酿酒酵母菌中表达，从而使酿酒酵母菌可以分泌淀粉酶。 

在基因工程中，酵母表达系统已经发展很久了，其最先使用的是酿酒酵母，因为酿酒酵母一直以来被认为是安全生物，并且遗传背景相对清楚。酿酒酵母表达载体可以有自主复制型游离质粒和随染色体同步复制的整合型两种。自主复制型质粒由于含有来自酵母天然质粒2μm复制起点序列ARS(autonomously replicating sequence)，能够独立于酵母染色体外自主复制，拷贝数通常可达30拷贝以上，但在多数情况下，如果没有选择压力，它们是不稳定的，容易丢失。整合型载体不含自主复制序列(ARS)，可整合到酵母宿主菌的染色体上，这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低。一般来说，外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系，所以，选用强启动子对高效表达就十分重要。目前，酿酒酵母组成型的强启动子有PGK、ADH1、GPD等，诱导型强启动子有GAL1、GAL7等。(董清华，沈元月.酵母表达系统研究进展与展望.北京农学院学报[J]，200823(2)：72-75.)酿酒酵母表达分泌到细胞外的蛋白质是通过信号肽来实现的，信号肽是存在于分泌蛋白质N末端的特异氨基酸序列，引导新合成的分泌性蛋白质至不同的转运系统。酵母表达系统的信号肽主要可以分为4种：一蛋白质自身信号肽，二酵母信号肽，三外源信号肽，四改造信号肽。(覃晓琳，刘朝奇，郑兰英。信号肽对酵母外源蛋白质分泌效率的影响[J]。生物技术，2010，20(3)：95-97.)现在已有多种淀粉酶基因在酿酒酵母中成功表达。 

然而，野生酿酒酵母一般在39℃(反刍动物瘤胃的温度)下代谢缓慢，分泌淀粉酶的能力降低，所以有必要得到耐高温的突变菌株。本发明就是构建一株在39℃下能正常生长的可 分泌淀粉酶的酿酒酵母用于反刍动物饲料添加剂，以促进瘤胃微生物发酵，提高生产性能和饲料中淀粉的利用率。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株耐高温的酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，其在中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)的保藏号为：CCTCC M 2014390。 

本发明的另一目的是提供一种真菌的编码α-淀粉酶的基因，极其编码的蛋白质。 

本发明的另一目的是提供包含上述α-淀粉酶基因的重组载体。 

本发明的另一目的是提供包含上述α-淀粉酶基因的工程菌。 

本发明的另一目的是提供上述工程菌在动物饲料中的应用。 

本发明的具体方法步骤： 

1.从牛瘤胃中筛选耐高温酿酒酵母菌：取少许瘤胃液加入马铃薯-葡萄糖液体培养基，39℃下富集耐高温酿酒酵母菌，然后在虎红培养基上39℃下分离耐高温酿酒酵母菌。筛选在39℃下生长最旺盛的一株酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，将其接种在淀粉-YPD培养基平板上生长。