[发明专利]猪Six1蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体来说是一种猪Six1蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

近年来，在猪的饲养过程中追求猪的快速生长率和瘦肉率导致猪肉品质的下降，这与消费者日益增长的肉质要求不相符合。肌纤维类型与猪肉品质密切相关，慢速氧化型肌纤维有助于猪肉嫩度和多汁性。因此，提高慢速氧化型肌纤维在肌肉中的比例可有效地改善猪肉品质。

Sixl属于Six转录因子家族重要成员，在骨骼肌早期肌源细胞决定和迁移、肌纤维形成和肌细胞增殖中起着重要作用。它可作为生肌决定因子家族的转录调节因子，调控肌纤维增殖和分化，并在肌纤维类型的决定过程中起着重要作用，是一种快肌纤维基因，可诱导慢肌纤维向快肌纤维的转化，参与肌纤维类型转化的调节，影响肌肉中快肌纤维和慢肌纤维的比例，进一步影响猪肉品质。天然的猪Sixl蛋白存在于多种器官组织中，以骨骼肌中的含量最丰富，其次为睾丸和骨髓，但分离纯化出组织中的猪Sixl蛋白技术难度较大，而化学合成成本过高，所以利用基因工程技术制备重组猪Sixl蛋白是解决上述问题的一个有效途径。

利用基因工程技术，以微生物为载体的原核表达系统生产外源蛋白具有广阔的应用前景，尤以大肠杆菌为宿主的原核表达系统是目前为止研究的最清楚的一套原核表达系统之一，因其遗传背景和生化特性清楚、具有生产周期短、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于工业化生产等优点，适于外源蛋白的表达，广泛应用于生产外源蛋白的实践中。

Sixl作为肌纤维类型的重要调控因子和猪肉品质的潜在影响因子，目前，市场上多针对人、小鼠及大鼠Sixl抗体，这些抗体与猪、牛、羊、兔、猴等有一定的交叉反应，但是针对猪Sixl的效价高、特异性好的抗体还没有。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易操作，能体外表达出猪Six1蛋白及其制备多克隆抗体的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种猪Six1蛋白的体外表达方法，包括下列步骤：

(1)提取猪背最长肌总RNA；

(2)构建用于表达猪Six1蛋白的大肠杆菌重组表达载体；

(3)将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，构建携带重组表达载体的基因工程菌；

(4)培养基因工程菌至OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入诱导剂IPTG，诱导猪Six1基因在该基因工程菌中表达；

(5)纯化表达系统表达的重组猪Six1；

(6)重组猪Six1蛋白表达形式的鉴定。

进一步的，步骤(2)中，构建载体时，克隆猪Six1基因的插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。

进一步的，步骤(2)中，构建载体时，所用的引物序列如下所示：

上游：5’-CCCAATTCCATATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTC-3’

下游：5’-AAACTCGAGGGACCCTAAGTCCACCAGACTGGAG-3’；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。

进一步的，步骤(4)中，诱导剂IPTG浓度为2mmol/L，诱导时间为2小时。

进一步的，步骤(5)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中的变性条件方法进行纯化。

进一步的，步骤(6)中，所述重组猪Six1蛋白表达形式的鉴定为超生破碎法，其中超声破碎功率为260W，超声破碎2秒，间隔5秒，作用30分钟，并经SDS-PAGE电泳分析。

本发明的第二目的是提供一种猪Six1蛋白，该重组猪Six1蛋白C端带有6个组氨酸标签。