[发明专利]一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种利用生物技术手段制备高活性复合纤维素酶，并涉及该复合纤维素酶在酶解糖化木质纤维素中的应用。

背景技术

木质纤维素是自然界中蕴藏量最丰富、最廉价的可再生资源，占地球总生物量的40％左右。通过生物转化技术将天然纤维素降解为可以利用的糖，对于缓解地球能源危机和环境污染具有重大意义。纤维素酶是指能降解纤维素的一类多组分复合酶系的总称，主要包括三个酶组分：内切型-β-葡聚糖酶(exdo-1，4-β-D-glucanase，EG)、外切型-β-葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。纤维素酶的作用机理是EG先降解纤维素分子内部的非结晶区形成新的游离末端；然后由CHB作用于纤维素线状分子非还原性末端水解β-1，4-糖苷键形成纤维二糖；最后由BG水解纤维二糖为2个葡萄糖。

在纤维素的酶解糖化过程中，若BG型酶不能有效的酶解纤维二糖，将会对EG酶和CHB酶产生很强的反馈抑制作用，最终限制纤维素的酶解糖化率。为提高纤维素酶的酶解糖化率，十分有必要通过人工措施制备具有高活性EG、CHB和BG型纤维素酶的复合纤维素酶。目前公认的能产生高活性EG和CHB型纤维素酶的菌种为里氏木霉，而该菌种所产的BG型纤维素酶活性较低。目前能产生高活性BG型纤维素酶的菌种为黑曲霉。将黑曲霉生产的β-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素酶，优化酶系配比，提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高活性复合纤维素酶及其制备方法和其在酶解糖化木质纤维素中的应用，本发明能够显著提高酶解糖化木质纤维素的效率，尤其能够提高对于蒸汽爆破杨木的酶解效率。

一种高活性复合纤维素酶的制备方法，分别将保藏编号为CCTCC NO：M 2012129的黑 曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.048～2.685；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25～30g/L，稻草粉20～30g/L，蛋白胨5～6g/L，(NH₄)₂SO₄10～13g/L，KH₂PO₄6～8g/L，CaCl₂·2H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，吐温-801～2ml/L，Mandels微量元素浓缩液0.5～1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100～150ml/L，加水配制成1L。

上述方法优选将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.536；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25g/L，稻草粉30g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9g/L，吐温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100ml/L，加水配制成1L。

上述方法中黑曲霉C112的产β-葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112的种子培养液，以体积百分比5-8％的接种量接种于装有40-60ml产酶培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液。

黑曲霉C112的种子培养：从保存的黑曲霉C112土豆固体平板培养基中挑取孢子，接种于装有40-60ml种子培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养2～3天作为接种物；黑曲霉C112种子培养基：马铃薯250～300g/L，葡萄糖15～25g/L，pH值6.5～7.0。