[发明专利]兔血中白蛋白的纯化制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物蛋白技术领域，具体涉及兔血中白蛋白的纯化制备方法。 

背景技术

兔血含有很高的营养价值，可加工成多种产品，供食用、药用，或作为畜禽的动物性饲料。兔血可提取多种生物药物和生化试剂，如医用血清、血清抗原、凝血酶、亮氨酸、蛋白胨等，兔血医用价值高，但目前兔血提取技术仅限于实验室应用，无法达到纯化提取，且不能产业化提取和生产，对兔血的应用存在一定的局限性。目前，应用最广泛的是牛血清白蛋白，用于细胞培养、WB封闭剂、代谢反应、生化测定、抗体稀释等，兔血清白蛋白在用于封闭剂、抗体稀释、生化测定等方面要优于牛血清白蛋白。常用的方法为盐析法和DEAE柱层析法，且在兔血方面主要是在实验室的小批量处理，本方法在处理量和纯度方面较之传统方法都有极大的提升。 

发明内容

为了克服现有技术存在的技术缺陷，本发明提供一种兔血中白蛋白的纯化制备方法，该方法操作简单，提取的白蛋白纯度高。 

兔血中白蛋白的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤： 

(1) 兔血前处理

a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠（柠檬酸钠）溶液中，并搅匀；

b. 连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清；

c. 将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液；

(2) 滤出液脱盐

采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样；

(3) 兔血白蛋白的分离

a. 冷沉淀：将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物；

b. 离心：将冷沉淀的溶液在4℃的条件下，离心约30min，收集上清液；

(4) 层析

a. 将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集穿透液。

所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料。Buffer A：15mM HAc-NaAc，pH为 5.2；Buffer B：25mM NaAc ，pH为 4.5。 

b. 将a中收集的穿透液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集二次穿透液。 

所述层析柱为450*200，填料为CM，装填高度为15cm，约需要22L填料。Buffer A：25mM HAc-NaAc，pH 为4.5；Buffer B：25mM NaAc + 0.25M NaCl ，pH为 5.5。 

(5) 超滤 

在进液口放入兔血白蛋白洗脱液中(pH为7.0)，待兔血白蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时，关闭超滤系统，收集进液管路和回流管路中的兔血白蛋白洗脱液。

将膜包用0.1M NaOH冲洗30min，再用水冲洗直至pH约为7，将膜包取出并置于保存液中，提取白蛋白纯度可达99%，与传统方法比较，提取效率可提高25%。 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行详细的描述。 

兔血中白蛋白的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤： 

(1) 兔血前处理

a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠（柠檬酸钠）溶液中，并搅匀；

b. 连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清；

c. 将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液；

(2) 滤出液脱盐

采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样；

(3) 兔血白蛋白的分离

a. 冷沉淀：将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物；

b. 离心：将冷沉淀的溶液在4℃的条件下，离心约30min，收集上清液；

(4) 层析

a. 将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集穿透液。