[发明专利]用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及食品及生物产品中耐药性大肠杆菌所携带的耐药基因的检测，尤其针对大肠杆菌所携带耐四环素基因的mPCR检测。

技术背景

大肠杆菌是常见的可引起人畜共患病的致病菌，食品动物来源的菌株具有耐药性可能对人类存在巨大的潜在危害，检测食品源、动物源等的大肠杆菌耐药性的研究尤为重要。由于细菌耐药性的研究主要为临床医学领域，而对于动物源性及食源性细菌的耐药性研究起步较晚，且往往由于细菌同时食物链传播给人类，人们对食物链的中间环节多着眼于细菌致病性的检测，而忽略了细菌耐药性。

在禽畜饲养中，四环素类抗生素被广泛的应用于对各类细菌性疾病的预防工作中，盲目加大抗生素使用剂量，使四环素在畜禽体内存留时间延长，使休药期增加。同时在畜产品生产过程也被用于提高家畜的生产性能，作为生长促进剂在饲料中随意或提高添加四环素；此外，屠宰前使用四环素类抗生素来掩盖患病家禽临床症状以逃避宰前检验。在动物体内或动物性相关食品中过量或大量的四环素残留，促使细菌产生耐药性，造成具有耐药性的病原菌引起人类食物中毒或感染疾病时，药物无法治疗，或耐药性菌株的耐药因子(如质粒、整合子等)通过食物链等途径流行传播，引起菌株耐药率提高，抗生素失效等严重后果。

大肠杆菌对四环素的耐药性几乎是所有抗生素中最严重的，且有研究表明患病动物体内大肠杆菌分离株的耐药性明显高于健康动物分离株，这种现象可能会造成患病动物的治疗难度增加，甚至会产生致病菌的耐药率提高的隐患。因此，检测四环素耐药基因，并监控其在动物源性食品的流行情况，以及在其他非动物源性食品流行情况对于预防四环素耐药菌株对人类及动物造成健康和经济上的危害，以及了解四环素耐药基因在大肠杆菌中的携带率，甚至是四环素的使用都具有重要意义。牛源大肠杆菌对四环素类药物的耐药率为30.5％，猪源大肠杆菌对四环素类药物耐药率高达96.3％，研究发现大肠杆菌最常见的耐受药物是四环素。Bryan等(2004)研究了从美国的人和各种动物体分离的大肠杆菌，发现tetA和tetB是最主要的大肠杆菌四环素耐药基因，其携带率分别为35％和63％。

目前，国内对动物源性细菌耐药性的方法主要依据临床和实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制订的《动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法》SN/T1944-2007进行体外细菌培养药敏性试验，而缺少快速检测食品中大肠杆菌耐药菌株的检测方法。体外细菌培养药敏性试验操作繁琐，不适于大量样品的检测，且只能检测菌株的耐药表型，而对于耐药基因尚未表达的耐药菌株易造成漏检。而且完成药敏鉴定的全自动生化鉴定仪价格昂贵，鉴定结果受操作人员的影响较大，也易造成假性耐药或假性敏感现象；此外该体外药敏试验的结果无法评估细菌耐药性对人体的危害。因此急需建立更加准确高效的检测方法，可以快速实现耐药菌株的鉴别，并可有效避免被测菌株因体外药敏试验而产生的假性耐药或假性敏感现象。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物，包括引物对SEQ ID NO.1/2和引物对SEQ ID NO.3/4。

关于这些引物对的描述如下表：

所述组合物被应用于PCR反应，针对性扩增待测样品中可能含有的目的基因片段，这些目的基因片段包括：大肠杆菌四环素耐药基因tetA和tetB。

本发明的目的之二在于提供一种用于耐四环素大肠杆菌检测的试剂盒，包括上述本发明的用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物。

显然，所述试剂盒可应用于PCR扩增，所述试剂盒中，除了包括上述特异性引物组合物，还可以包括用于PCR反应的其它组分，所述组分包括但不限于Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCR缓冲液以及水。

所述试剂盒试剂盒保存条件：-20℃保存。

本发明再一方面的目的在于提供一种检测耐四环素大肠杆菌的方法，包括PCR反应的步骤，所述PCR反应使用上文所述本发明的用于耐四环素大肠杆菌检测组合物为mPCR扩增引物。

具体的实施方案中，本发明的检测耐四环素大肠杆菌的方法中所述的PCR反应体系总体积25μL，包括：待测样品DNA溶液1μl，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，PCR反应液12μL和余量的水；