[发明专利]一种DNA扩增方法

说明书

本发明提供一种DNA扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括将T7启动子序列添加到目标DNA末端的步骤。本发明所提供的扩增方法，可以基于痕量DNA，小于1纳克DNA甚至单细胞基因组DNA进行扩增；含有T7启动子序列的目标DNA实现了相对均匀的扩增；可有效去除扩增过程产生的错误。

技术领域

本发明涉及一种DNA扩增方法。

背景技术

随着二代测序技术的快速发展，千人基因组计划、癌症基因组计划等的相继展开，基因组研究也日趋成熟。但是，由于二代测序文库构建本身的特点，文库构建时所需要的起始DNA量要在微克水平。随着技术的不断进步，现在有些商业试剂盒已经能将文库构建起始所需的DNA降低到纳克水平。如何对痕量DNA(小于1纳克DNA甚至单细胞基因组DNA)进行有效的文库构建和测序成为一个关键的问题。如何有效、均衡的扩增痕量DNA，成为痕量DNA测序的最大障碍。

现在最常用的痕量DNA扩增方式，是通过多重链置换反应(MDA)。但由于MDA扩增痕量DNA存在高度不均一性，这些扩增的偏好性导致了很难有效的组装微生物基因组、识别哺乳细胞中的拷贝数变异，单碱基点突变等。Chitsaz,H等通过设计耐受偏好性的算法来有效利用具有偏好性的数据。Hutchison等通过减小MDA反应的体积来减少MDA扩增产生的偏好性。Pan,X等通过海藻糖优化MDA的反应体系来增加MDA扩增的特异性。这些方法在一定程度上改进了痕量DNA扩增均衡性的问题，但是MDA扩增的均衡性仍然是痕量DNA扩增的最大挑战。

发明内容

为了解决现有技术中DNA测序存在的均衡性问题，本发明实施例提供一种DNA扩增方法。

本发明了涉及一种DNA扩增方法，该方法基于体外转录的方式，线性扩增痕量DNA，有效的保证了痕量DNA扩增的均衡性。

本发明的一个方面，涉及一种DNA扩增方法，该方法包括将T7启动子序列添加到目标DNA末端的步骤。

所述将T7启动子序列添加到目标DNA末端的步骤，可以是用Ez-Tn5转座酶将末端带有T7启动子序列的接头转座插入到目标DNA，也可以是通过末端带有T7启动子序列的随机引物通过聚合反应加入到目标DNA。

所述DNA测序方法还包括，通过T7启动子体外转录的方式均衡扩增含有T7启动子序列的目标DNA的步骤。

具体来讲，所述DNA扩增方法可以包括如下步骤：

合成Ez-Tn5转座酶能识别的末端带有T7启动子序列的镶嵌末端(MosaicEnd)及镶嵌末端(不含T7启动子序列)的互补序列，将两条序列退火后与Ez-Tn5转座酶组装成为含T7启动子序列的转座子；

将上述转座子转座插入目标DNA(小于1纳克DNA甚至单细胞裂解后的基因组DNA)，加入核酸外切酶I(切割方向3’->5’)消化多余的接头和单链DNA；

通过链置换酶、切口转移酶或者填充缺口的酶补平已带有T7启动子的目标DNA；

加入能消化单链DNA的核酸外切酶(如：RecJf外切酶)进一步消化新产生的单链DNA；

加入T7启动子体外转录试剂，进行T7启动子体外转录。

所述DNA测序方法还可以是包括如下步骤的：

合成末端带有随机引物的T7启动子序列，该序列比如可以是SEQ ID No：2所示的序列：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3’)；

采用具有链置换活性的酶(如phi29DNA polymerase)与单链模板恒温反应，或者采用无链置换活性的DNA聚合酶通过PCR的方式反应，形成末端带T7启动子序列的DNA片段；