[发明专利]一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备方法。

背景技术

肌钙蛋白是由3个亚单位，即肌钙蛋白C、肌钙蛋白I及肌钙蛋白T组成的复合物。肌钙蛋白(cTn)被认为是目前用于ACS诊断最特异的生化marker，它们出现早，最早可在症状发作后2h出现；具有较宽的诊断窗：cTnT(5～14天)，cTnI(4～10天)。在它们的诊断窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5～10倍。由于在无心肌损伤时cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage(MMD，微小心肌损伤)的诊断，这是以前酶学指标所难以做到的。cTn还具有判断预后的价值，对任何冠状动脉疾患病人，即便ECG或其他检查(如运动试验)阴性，只要cTn增高，应视为具有高危险性。

心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，CTnI)是一项新的心肌损伤的特异性和敏感性指标，同其它检测指标相比，CTnI在血液中出现早、持续时间长、特异性强，作为心肌轻度受损的指标，对急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、不稳定型心绞痛(unstable angina Oectoris，UAP)、围手术期心肌损伤等疾病的诊断、病情监测、疗效观察及预后评估都具有较高的临床价值。

Tnl存在三种不同的亚基，即慢收缩骨骼肌TnI、快收缩骨骼肌TnI和心肌收缩Tnl(CTnI)，分别有三种不同基因编码，快、慢收缩骨骼肌TnI与CTnI在氨基酸排列顺序上仅有4％相同，且后者比前者在N末端多31个氨基酸残基。前者分子量为19.8 kDa，后者为225 kDa，不同组织来源的TnI有组织特异性而无种属特异性，而CTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年人各阶段的CTnI均相同，所以CTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志。在心肌细胞膜完整时CTnI不能透过细咆膜进人血循环，当心肌细胞因缺血缺氧而发生变性坏死时，CTnI可通过破损的细胞膜弥散进人细胞间质，随之进人血管和淋巴管中。由于CTnI分子量较小，并持续从变性细胞内逸出，心肌损伤后CTnI3～6 h开始升高，14～20 h达高峰，血中可持续5～7天，故CTnI作为心肌损害的指标有较高特异性。

肌钙蛋白I（CTnI）检测方法主要有：放射免疫法（RIA）、酶免疫测定法（ELISA）、酶免疫化学发光法（CLIA）、胶乳增强免疫比浊法。现在放射免疫法存在辐射，酶免疫测定法灵敏度较差，而酶免疫化学发光法成本较高，所以胶乳增强免疫比浊法结合全自动生化分析仪进行检测的方法，最为常见。其原理为将特异性抗体结合于胶乳颗粒表面，制备致敏微球，样本与致敏微球颗粒在缓冲液中混合，样本中的TnI与致敏微球颗粒表面的抗体结合，使相邻的致敏微球颗粒彼此交联，在505nm波长下检测溶液浊度变化，变化程度与样本中的TnI含量成正比。

常规方法制备致敏微球颗粒的方式有物理吸附法和化学交联法，但是两种方法都会影响抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体的免疫活性，而且一些非特异性吸附造成本底较大，严重影响了抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体致敏微球的应用。

发明内容

针对于上述常规方法制备抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体致敏微球颗粒方法存在的问题，本发明提供了一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备工艺，应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法），检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），保证了试剂盒的准确度。

本发明是通过以下措施实现的：

一种高活性肌钙蛋白I致敏微球的制备工艺，其操作流程如下：

（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为70-140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为0.5-5%，加入亲和素，最终浓度为1-10%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时，用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，用浓度为0.05M， pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰；