[发明专利]一种从长春花中提取长春碱的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从长春花中提取长春碱的新方法，尤其涉及一种利用生物酶-双频超声波相结合提取长春碱的方法，属于天然药物技术领域。

背景技术

长春花又名雁来红、日日新、四时春、三万花，是夹竹桃科植物长春花的全草。长春花中含有大量的生物碱，结构复杂，热稳定性差，且含量甚微。长春碱是其中最主要的一种，为针状晶体，不溶于水、石油醚，溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、甲醇，味苦，有引湿性，遇光或热色渐变黄，mp211~216℃，具有抗肿瘤活性，可用于治疗何杰金氏病和绒毛上皮癌、淋巴肉瘤和卵巢癌等。

目前长春碱的提取方法主要有浸泡法、渗漉法、回流法等传统中药提取方法，但这些方法提取效率较低、操作繁琐。近年来也有用超声波提取和微波提取的方法，但单频超声波容易产生驻波，而微波温度较高易破坏热不稳定成分，从而影响长春碱的提取。本发明利用酶解破坏细胞壁和双频超声的空化效应，在低温下即可得到高的提取率，为热不稳定物质的提取提供了一种新的强化方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种反应条件温和、提取率高、纯度高的提取分离长春碱的新方法。

本发明包括以下步骤：

a. 将长春花去除杂质后粉碎，过50目筛，得粉末； 

b.取粉末，加入5~8倍的70~80%的乙醇溶液，加硫酸调节PH为2.0~3.0，1h后加入长春花重量0.02~0.05%的生物酶，放入双频超声装置中，超声频率分别为20Hz、40Hz，超声功率为300~400W，于40~50℃酶解5~6h；

c.酶解液过滤，滤液用浓氨水调PH10.0，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，得浓缩物；

d.将步骤c中的浓缩物用少量乙醇溶解，经硅胶柱层析，以V（二氯甲烷）与V（甲醇）为18:1洗脱剂进行纯化，收集洗脱液，浓缩，得高纯度的长春碱。

步骤b中所述的生物酶为纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶以0.5:0.2:0.3混合的复合酶。

步骤b中所述的超声功率为双频超声作用时总功率（20KHz与40KHz各取一半）。

本发明选用纤维素酶、半纤维素酶来水解结构致密的植物细胞壁，有利于胞内物质的溶出；而果胶酶能将长春花中的果胶质等不溶物水解。再结合双频超声波振动的空化作用，减少驻波，在低温下即可得到较高的提取率，避免了高温使长春碱的分解氧化。该方法工艺简单、成本低、反应条件温和、提取率高、纯度高，适于工业化生产。

下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式：

实施例1：

将长春花去除杂质后粉碎，过50目筛，取500g粉末，加入8倍的70%的乙醇溶液，加硫酸调节PH为2.0，1h后加入长春花重量0.02%的生物酶（纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶为0.5:0.2:0.3），放入双频超声装置中，超声频率分别为20Hz、40Hz，超声功率为300W，于40℃酶解5h，酶解液过滤，滤液用浓氨水调PH10.0，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，将浓缩物用少量乙醇溶解，经硅胶柱层析，以V（二氯甲烷）与V（甲醇）为18:1洗脱剂进行纯化，收集洗脱液，浓缩，得长春碱0.18g，纯度为96.1%。

实施例2：

将长春花去除杂质后粉碎，过50目筛，取500g粉末，加入6倍的80%的乙醇溶液，加硫酸调节PH为2.5，1h后加入长春花重量0.04%的生物酶（纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶为0.5:0.2:0.3），放入双频超声装置中，超声频率分别为20Hz、40Hz，超声功率为400W，于45℃酶解6h，酶解液过滤，滤液用浓氨水调PH10.0，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，将浓缩物用少量乙醇溶解，经硅胶柱层析，以V（二氯甲烷）与V（甲醇）为18:1洗脱剂进行纯化，收集洗脱液，浓缩，得长春碱0.24g，纯度为98.8%。

实施例3：

将长春花去除杂质后粉碎，过50目筛，取500g粉末，加入5倍的75%的乙醇溶液，加硫酸调节PH为3.0，1h后加入长春花重量0.05%的生物酶（纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶为0.5:0.2:0.3），放入双频超声装置中，超声频率分别为20Hz、40Hz，超声功率为350W，于50℃酶解5.5h，酶解液过滤，滤液用浓氨水调PH10.0，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，将浓缩物用少量乙醇溶解，经硅胶柱层析，以V（二氯甲烷）与V（甲醇）为18:1洗脱剂进行纯化，收集洗脱液，浓缩，得长春碱0.19g，纯度为97.5%。