[发明专利]一种复合羊膜粉的制备方法及制备得到的复合羊膜粉

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，尤其是涉及一种复合羊膜粉的制备方法及制备得到的复合羊膜粉。

背景技术

羊膜是胎盘的最内层，厚约0.02～0.5mm，在光镜和电镜下，可分为上皮层和基质层，根据纤维排列结构及所含细胞不同，基质层又可分为基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层4层，基质层含有大量的胶原，主要为i、iii、iv、v、vii型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，可为组织修复提供营养支持。

羊膜上皮及基质含有一些生长因子如：碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)和转化生长因子-β(tgf-β)等，这些因子能促进上皮化发生，有利于上皮细胞的分化、移行和增强上皮细胞的粘附性，细胞因子是一类具有生物活性的蛋白质分子。

研究显示：羊膜基质层含有独特的间质成份，能抑制转化生长因子β信号增生和抑制正常人类角膜、角膜缘纤维母细胞的肌纤维母细胞的增殖及其向纤维细胞分化，因而羊膜还具有抑制纤维化，减轻瘢痕形成的功能。

人羊膜上皮细胞表面不表达hla－a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白。表达ib抗原、限制ia抗原，这些免疫学上的特点使羊膜无免疫原性。

羊膜是可降解的天然高分子材料，其优良的生物学性状，使其作为一种宝贵的自然资源具有开发应用的广阔前景。羊膜片移植不仅可以用于眼表重建，还可以用于促进肌腱损伤修复，促进周围神经再生修复，促进骨膜生长及骨愈合，烧伤外科、整形外科、妇科、泌尿外科等重建黏膜和皮肤组织，在干细胞研究及组织工程研究领域的应用也取得了可喜成果。

国内外羊膜的临床应用范围在不断拓展，由于羊膜移植片在一些微创手术中应用受到限制，本发明采用人羊膜在保护剂中被低温加工成粉状，保留羊膜主要生物活性，使羊膜粉能用于微创手术及介入材料，发挥羊膜在特殊部位的预防炎症，加速组织修复等应有的功能。

申请公布号为CN101316602A(申请号为200680044389.3)的进入中国国家阶段的PCT发明专利申请公开了羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法，该专利具体公开的是胎盘组织经匀浆、离心、冻干后制得一种含透明质酸(HA)、肿瘤坏死因子剌激基因6(TSG-6)、五聚环蛋白(PTX-3)和血小板反应蛋白(TSP-1)的纯化组合物及其应用，没有提及制备过程活性蛋白的保护问题，这种方式存在的缺陷在于：

(1)胎盘、羊膜在粉碎过程中，局部高温和氧化会使羊膜本身的活性因子变性失活。

(2)羊膜组织主要以胶原蛋白为主，是水不溶性的结构蛋白；羊膜上皮层及基质中含有丰富的活性因子，即功能性蛋白，常用的活性蛋白保护剂种类很多，包括糖、氨基酸、高分子材料、表面活性剂等，多数保护剂在加工过程中的耐酸、碱、盐、热等特性以及其控制液体流变性质的能力都不能达到对羊膜粉的保护要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合羊膜粉的制备方法，解决羊膜片粉碎过程细胞因子活性保护的问题，该复合羊膜粉材料羊膜活性因子得到保留，可在常温下保存，并可与多种粉状、液状、水性、油性药物或药用材料等进行复配，适用于微创介入或特殊创面修复的需求。

本发明的另一个目的在于提供该方法制备得到的复合羊膜粉。

本发明采用如下技术方案实现：一种复合羊膜粉的制备方法，包括以下步骤：

1)羊膜取材与清洗：按标准(YZB/国1340-2013)进行羊膜取材，在洁净无菌环境下，将新鲜羊膜用无菌生理盐水冲洗除去血渍，控干盐水；

2)保护活性因子：将黄原胶溶解在0.1M～1M、PH＝6.8～7.5的缓冲溶液中配置质量浓度为0.01％～0.5％的黄原胶溶液，将经过步骤1处理的羊膜置入该黄原胶溶液中，羊膜与黄原胶溶液的质量比为1：1～100，旋转混合20min～30min，旋转混合的转速为10r/min～100r/min；

3)低温粉碎：在-190℃～-4℃的低温环境下，将经过步骤2处理的羊膜和黄原胶溶液的混合物进行磨碎处理，再在4℃～10℃下过100目～200目筛，滤过液在4℃～10℃下离心脱水5min～10min，离心脱水的转速为8000r/min～15000r/min，得离心沉淀物；

4)冷冻干燥：将步骤3中制得的离心沉淀物冷冻干燥至含水量为3％～10％，即制得复合羊膜粉。

进一步的，步骤2中所述缓冲溶液为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、柠檬酸/柠檬酸钠中的一种。

进一步的，步骤3中所述低温环境是通过液氮或干冰制造。