[发明专利]一种微生物基因改造方法、用于生产高级脂肪醇、高级脂肪烃的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种微生物基因改造方法、 用于生产高级脂肪醇、高级脂肪烃的基因工程菌及其应用。

背景技术

当今世界能源问题成为世界经济发展的瓶颈，利用生物质等可再生资源进行物 质的生产成为当今科学研究的热点。

高级脂肪醇不仅是高效的生物柴油，而且在医学和日化用品中也有重要的用途。 随着石油资源的枯竭，脂肪醇的生物法生产受到越来越多的关注。长链的烷类和烯 类是最具前景的生物燃料。其物理性状熔点较低，在生物燃料中最适于用作能源物 质。因此发酵法生产的高级脂肪醇和高级烃类将是一种绿色平台化学品。综合已有 文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的包括能够积累高级脂肪醇和高级烃类 的藻类、用于表面活性剂生产的假单胞菌、遗传和操作背景都很清楚的大肠杆菌等。 其中大肠杆菌的培养条件简单，菌种本身有高级脂肪醇和高级烃类代谢途径，具有 代谢灵活性，易于基因工程改造。对大肠杆菌高级脂肪醇和高级烃类代谢的研究表 明，在以葡萄糖为底物的高级烃的发酵中，高级脂肪醇和高级烃类生成过程如下：(1) 通过糖酵解形成乙酰-CoA；(2)乙酰-CoA进入脂肪酸合成路径形成脂酰-ACP(3) 脂酰-ACP经由脂肪酸形成脂酰-CoA；(4)脂酰-CoA被还原为脂肪醇或经由脂肪醛 还原为高烷类或烯类。

目前国内外对大肠杆菌生产高级脂肪醇和高级烃类的代谢网络途径改造有以下 两种：1、过量表达内源的TesA’(硫酯酶I，ThioesteraseI)和FadD(脂酰-CoA合 成酶，fattyacyl-CoAsynthetase)，与此同时过量表达异源的FAR(脂酰-CoA还原酶， fattyacyl-CoAreductase)。这种改造的出发点是将脂肪酸合成路径的中间产物脂酰 -ACP经由脂酰-CoA转化为脂肪醇。2、过量表达内源的TesA’和FadD，与此同时过 量表达异源的Acyl-ACP还原酶和脂肪醛还原酶。以上改造的出发点是将脂肪酸合 成路径的中间产物脂酰-ACP经由脂酰-CoA、脂肪醛转化为烷类和烯类。这两种改造 方法的缺陷是产物烃类的合成都要经由脂肪酸和脂酰-CoA，由于脂肪酸合成、β氧 化都是在胞质内完成的，且脂肪酸的积累对细胞毒性较大，不会高浓度积累，这限 制了这类途径可能达到的最高产量。此外，脂酰-CoA极易被TesA和TesB(硫酯酶 II，ThioesteraseII)酯解为脂肪酸，这样便阻断了其进一步还原为脂肪醇和脂肪醛进 而形成烷类和烯类的可能性。因此急需一种具有开发潜力的高级脂肪醇和高级烃类 的合成路径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物基因改造方法用于生产高级脂肪醇和高级脂 肪烃。本发明的目的还在于提供基因工程菌以及使用本发明的基因工程菌发酵多种 碳源生产高级脂肪醇和高级烃类的方法。

本发明的微生物基因改造方法，包括删除微生物细胞内由脂酰-ACP生成脂肪酸 的路径以减少胞质内自由脂肪酸生成的步骤；其中，所述删除微生物细胞内由脂酰 -ACP生成脂肪酸的路径的方法为将微生物中的硫酯酶TesC编码基因敲除。

优选地，本发明所述微生物为大肠杆菌。

本发明的用于生产高级脂肪醇的基因工程菌，体内不含硫酯酶TESC，且含有包 含编码外源脂酰-CoA还原酶FAR的基因片段的重组质粒。

上述基因工程菌体内的硫酯酶TESC通过将硫酯酶TESC编码基因TesC敲除的 方法删除。

本发明所述包含外源脂酰-CoA还原酶FAR的编码基因片段的重组质粒，优选 地，所述重组质粒为pTr-FAR，即将外源脂酰-CoA还原酶FAR的编码基因序列连接 于质粒pTrcHisA上。

本发明所述外源脂-CoA还原酶FAR的编码基因片段，其核苷酸序列如SEQID No.1所示：

本发明的制备上述用于生产高级脂肪醇的重组质粒的方法，包括以下步骤：

1)克隆获得两端分别带有限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切位点的包含脂酰 -CoA还原酶FAR的编码基因序列的DNA片段；

2)将上述DNA片段与空质粒经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切并连接， 获得重组质粒。