[发明专利]一种运用重组唾液酸酶转化多唾液酸神经节苷脂制备单唾液四己糖神经节苷脂的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶法转化制备单唾液四己糖神经节苷脂领域，更具体地涉及一种运用重组唾液酸酶转化多唾液酸神经节苷脂制备单唾液四己糖神经节苷脂的方法。

背景技术

神经节苷脂是含唾液酸的鞘糖脂。1942年Klenk首先在神经节细胞内找到这类化合物，故名神经节苷脂。神经节苷脂由神经酰胺、寡糖和唾液酸组成。神经节苷脂所含的寡糖是一种特异的以β-糖苷键连接的四糖。四糖按半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(N-GalNAC)、半乳糖及葡萄糖(Glu)顺序连接，最后通过葡萄糖残基与神经酰胺(Cer)相连。神经节苷脂的唾液酸残基均连接于寡糖的半乳糖基上，其数目从无(无唾液酸神经节苷脂)到四个或更多不等。目前已从脑组织中分离出30多种神经节苷脂，其命名通常采用Svennerholm法，主要内容包括：(1)：用大写“G”表示神经节苷脂；(2)用A、M、D、T、Q、P、H、S分别表示含0-7个唾液酸；(3)用(5-糖基数)之差表示含相同唾液酸但不同糖基数的神经节苷脂；(4)用a、b、c表示唾液酸的连接部位。

下图举例说明一个神经节苷脂缩写名称中各部分含义。

神经节苷脂几乎存在于所有哺乳类动物组织中，不同种系、组织和细胞间神经节苷脂的质和量差异很大。在神经系统中含量丰富，尤其在脑灰质中含量最高，到达2.5μmol乙酰神经氨酸/克湿重(干重的2％或者总脂类的5％)。与其它糖鞘脂一样，神经节苷脂主要存在于细胞浆膜的外部，亲脂性的酰基鞘氨醇镶嵌在膜的脂双层中，亲水性基团(碳水化合物)部分则突出于细胞外液中。作为膜抗原和病毒、细菌及毒素的受体，多唾液酸神经节苷脂(GLS)在细胞识别，细胞粘合，调节细胞免疫，决定血型等方面起着非常重要的作用。神经节苷脂水解产生的神经酰胺(ceramide)，是一种抑制性第二信使，参与多种细胞功能，具有调节细胞生长、变异、凋亡，调节蛋白分泌，参与免疫过程与炎症反应等功能。其中含有一个唾液酸的GLS称为单唾液四己糖神经节苷脂(GM1)，它能够通过血-脑脊液屏障，聚集受损脑区嵌入细胞膜，模仿内源性GM1发挥作用，能够促进神经细胞生存、轴突生长和突触生长的神经重构，恢复由于各种原因引起的中枢神经系统损伤的功能，而且对损伤后继发性神经退化和脑水肿也有积极作用。1996年我国从阿根廷TRB Pharma公司引进了利用猪脑生产的GM1注射液，商品名为Sygen(施捷因)，用于治疗颅脑损伤、神经退化、帕金森综合征等脑部疾病。

目前单唾液四己糖神经节苷脂(GM1)的生产工艺大多采用溶剂萃取、酸法水解转化和柱层析等分离提取程序从脑组织中分离纯化得到GM1单体。单唾液四己糖神经节苷脂(GM1)一般以大约10％的含量存在于自然的神经节苷脂混合物中，因此从中分离GM1是不经济的。该方法制备GM1需要消耗大量有机溶剂，成本高，而且剩余大量的多唾液酸神经节苷脂无法应用，是一种很大的浪费。

用微生物酶法和化学法转化多唾液酸神经节苷脂混合物生成GM1是目前最可行的工业方法。相对于酸法转化，利用微生物和唾液酸酶转化法生产GM1具有专一性高，反应条件温和等优点，可以将多唾液酸神经节苷脂专一性地转化为GM1，提取分离后未转化的多唾液酸神经节苷脂仍可用于下一批次的转化，经转化后的样品中几乎不含三个唾液酸的GT1a和GT1b，仅含少量两个唾液酸的GD1a和GD1bGD组分，转化效果明显优于酸转化法，并且减少了溶剂消耗。而且微生物培养和转化过程的成本低，能够显著提高生产效率，降低GM1的生产成本。

美国专利US5756314A中利用一株产唾液酸酶的假单胞菌可以高效地转化多唾液酸神经节苷脂产GM1，而对GM1不起作用。这株假单胞菌是从海洋中分离得到的，当时来说它具有对人类相对低的致病性。但是运用在规模生产GM1的过程中还是有很大的风险。

欧洲专利EP0540790A1中利用琼脂糖固定化的唾液酸酶转化多唾液酸神经节苷脂产GM1，这种唾液酸酶是从产气荚膜梭菌中分离出来的。琼脂糖固定化的唾液酸酶与游离的相比，固定化酶的pH稳定性更好。主要的优点是可以重复使用，很大的节约该游离酶的高成本。但是成本相对来还是非常高。不适合运用到大规模生产GM1中。