[发明专利]用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测，尤其涉及一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒。 

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV感染引起宿主肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损坏的疾病，叫乙型病毒性肝炎，俗称乙肝。 

HBV主要经血和血制品、母婴、破损的皮肤和黏膜及性接触传播。HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果表明，我国1～59岁一般人群乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)携带率为7.18％，5岁以下儿童的HBsAg携带率仅为0.96％。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。 

根据HBV全基因序列差异≥8％或S区基因序列差异≥4％，目前将HBV分为A～I 9个基因型。HBV基因型呈地域性流行，我国及亚洲常见的是B、C以及少量的D型。不同基因型HBV对药物的敏感不同与疾病进程的关系也不相同，HBV-C较HBV-B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率HBV-A高于HBV-D型而HBV-B型高于HBV-C型。 

目前国内外对于慢性HBV感染患者的治疗共识是抗病毒长期治疗。HBV是一种突变率极高的病毒，自然突变率10^10-11点突变/天，在长期药物治疗特别是核苷(酸)类似物药物选择压力下，HBV耐药突变发生频率高，临床耐药突变成为影响慢性乙肝治疗效果的主要因素之一。我国SFDA批准上市的核苷(酸)类似物药物有4种：拉米夫定(Lamivudine，LAM)、替比夫定(Telbivudine， LdT)、阿德福韦酯(Adefovir，ADV)和恩替卡韦(Entecavir，ETV)；随着用药年限的增加，耐药发生率逐年递增。此外还有一种新药替诺福韦(Tenofovir，TDF)已经在欧美上市，虽然全球多中心临床研究尚未发现表型耐药，但大量的试验研究已经确定了TDF的具体耐药突变位点(表1)。 

表1核苷(酸)类似物药物热点耐药突变位点 

注：S：敏感；I：中度耐药；R：耐药。 

现有技术中，要么只能进行耐药突变检测，要么只能进行分型检测，而且，现有的检测耐药突变的产品或专利中，检测的耐药突变类型不够全面，有的产品甚至未包含与恩替卡韦耐药密切相关的突变位点(rt184、rt202、rt250)；有的产品包含了这些位点，但包含的突变类型也不够全面；这将导致一些突变类型无法检出，导致检测报告不够全面，给临床指导造成困扰。另外，根据HBV分型的原则，HBV全基因序列差异≥8％或S区基因序列差异≥4％分为一个基因型。而现有的分型检测产品或专利中，只用少量的探针(1条或2条)进行分型，也就是说只用到基因组中的一两个位点进行分型，不够科学准确，或造成错检 漏检，也无法检出重组型别。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测结果准确、检测灵敏度高且检测时间短的能同时进行HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，其所述核酸膜条包括G-膜条和M-膜条； 

所述G-膜条包括用于乙型肝炎病毒分型的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO：1-24； 

所述M-膜条包括用于乙型肝炎病毒耐药突变检测的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO：25-58； 

本发明的另一技术方案为提供一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，G-PCR反应液和M-PCR反应液； 

所述G-PCR反应液包括分型扩增引物，所述分型扩增引物碱基序列如：SEQ ID NO：59-68； 

所述M-PCR反应液包括耐药突变扩增引物，所述耐药突变扩增引物碱基序列如：SEQ ID NO：69-74；