[发明专利]超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法

权利要求书

1.超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，

所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；

采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：

(1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；

(2)流动相：

流动相A：0.1％v/v三氟乙酸水溶液；

流动相B：乙醇；

流动相C：0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；

流动相梯度见表1，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；

表1 流动相梯度洗脱参数

表2 波长切换参数

(3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；

(4)柱温：30℃；

(5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表2；

(6)进样量：1μL。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。

3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL离心管中，向其中加入200μL冷冻乙醇涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。

4.根据权利要求1所述的超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：

(a)标准品母液配制：分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、β-胡萝卜素17.12mg、蕃茄红素10mg、辅酶Q105mg、叶黄素20mg分别定容于2mL、10mL、1mL、1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；

(b)校正液配制：分别从维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚母液中移取40μL、80μL、40μL、20μL标准品母液用乙醇定容至1000μL得到校正液A，分别从α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、蕃茄红素、辅酶Q10、叶黄素母液中移取40μL、200μL、20μL、100μL、50μL标准品母液用正己烷定容至1000μL得到校正液B，分别取A、B各20μL用乙醇定容至1000μL，得到9种维生素标准品混合母液C，分别取其中12.5μL、25μL、50μL、200μL、500μL用空白血清基质溶液定容至1000μL，得到5个浓度标准校正点S1、S2、S3、S4、S5，具体数值见表3；

表3 9种维生素对应线性浓度范围单位μg/mL

(c)标准品处理：将上述所得S1、S2、S3、S4、S5五个浓度标准校正点各取200μL转移至1.5mL离心管中，向其中加入200μL乙醇，涡旋数秒，加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，待离心结束后，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，在氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。