[发明专利]基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质酶基因及dsRNA

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于基因沉默技术的舞毒蛾致死基因片段Chitinase5及其dsRNA和dsRNA在致死害虫中的应用。

背景技术

在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致昆虫对多种农药产生了不同程度的抗药性，例如，对于害虫舞毒蛾需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外，舞毒蛾还会影响人类健康，当人们直接接触舞毒蛾时，常会发生红肿发痒现象，严重者甚至产生皮疹。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工成大小约为22nt的小RNA（siRNA），通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。

在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。

几丁质降解和代谢是昆虫等节肢动物体内特有的生物学现象，由于人类和其他高等动物体内不含几丁质，因此昆虫几丁质降解系统已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。几丁质酶在昆虫几丁质的降解过程中起着关键作用，采用RNA干扰技术，开展几丁质酶dsRNA在害虫防治中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫舞毒蛾的几丁质酶5基因和其致死基因片段，由该基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害虫舞毒蛾中的应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种舞毒蛾的几丁质酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；是通过设计昆虫几丁质酶的简并引物后，PCR扩增获得其保守区，通过RACE-PCR扩增获得全长，命名为LdCHT5。其全长为1895bp，其中可读框1737bp，编码578个氨基酸，5＇-UTR和3＇-UTR的长度分别为42bp和116bp。

上述舞毒蛾的几丁质酶5基因的致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，经PCR扩增获得。

进一步利用相关试剂盒，根据舞毒蛾的几丁质酶5基因致死片段合成dsRNA。

dsRNA在致死害虫中的应用：注射dsRNA到舞毒蛾的预蛹期幼虫体腔，结果表明：在昆虫体内，dsRNA可以特异性的沉默几丁质酶5基因的mRNA表达，致使舞毒蛾因蜕皮困难死亡。

本发明设计合理，获得了舞毒蛾的几丁质酶5基因的致死基因片段，及由该基因片段合成的dsRNA，提供了针对害虫舞毒蛾的一种生物学防治方法，有望减少农药的大量使用，保护环境，降低生产成本，提高经济收益，具有市场应用前景。

附图说明

图1表示预蛹期舞毒蛾幼虫注射dsRNA后对其生长发育的影响。注射dsRNA的实验组（图中A、B）出现蜕皮困难无法化为成虫而死亡的表型，注射DEPC处理水的对照组（图中C、D）发育正常。

具体实施方式

实施例1

舞毒蛾几丁质酶5基因全长的获得方法如下：

（1）、PCR引物的设计

根据已知的昆虫几丁质酶5的氨基酸保守序列，设计了如下简并性引物如下：

上游引物：CHT5F 5'-GAYTGGGAGTACCCHGG-3'，

下游引物：CHT5R 5'-TCCATRTCRATRGCCCA-3'；

（2）、舞毒蛾几丁质酶5基因RACE引物的设计

基于上述得到的片段设计引物如下：

5'RACE上游引物：5'- CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(C)₁₆-3'

5'RACE下游引物：5'- GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3'

3'RACE上游引物：5'- GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3'

3'RACE下游引物：5'- CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈-3'

所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

（3）舞毒蛾总RNA的获得