[发明专利]利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组织的化学染色方法

说明书

技术领域

本发明属于生物染色技术领域，具体涉及一种还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶化学染色方法。

背景技术

先天性巨结肠(HD)是一种儿童常见的消化道发育畸形，可以引起婴儿肠梗阻和慢性便秘，在我国的发病率约为1:5000，为小儿外科最常见的先天性畸形之一，一般而言，在手术中根据术者经验及肠管的大体观察去判断病变段肠段范围，如术中行快速冰冻切片HE染色，遇到不典型病例或病理科医师经验不足，明显会影响肠管切除范围的判定，导致手术效果不佳，部分患儿还有反复的便秘或大便失禁，需再次手术切除剩余部分病变肠管，严重影响患儿的生活质量。

目前研究较多的术中快速诊断方法有：冰冻切片HE染色法、AchE染色、LDH染色法，但都不甚理想。如前所述，HE染色法可以观察肠壁有无神经节细胞的存在，神经纤维有无异常增生，如果全部切片都未见神经节细胞，则可诊断为HD。但小儿的神经节细胞发育是一个逐渐成熟的过程，尤其在新生儿时期，发育更是不成熟，故HE染色对于识别发育未成熟、结构不典型的神经节细胞有一定难度，因此经验在诊断上特别重要，直接影响诊断的准确率。与此相反，NADPH-d的快速染色法对于神经节细胞具有高识别性，Montedonico等认为特别适合诊断新生儿期HD。另外HE染色流程中需固定、脱水等较多步骤，耗时长。在HD病变段肠管中，AchE活性异常升高，通过AchE染色显色反应可看到胆碱能神经纤维大量增生，过去该流程要花费数小时，影响术中快速诊断的应用。Kobayashi等改进了新方法，使染色时间缩短到6min，使术中快速诊断成为可能。但AchE既存在于胆碱能神经元也存在于非胆碱能神经元，假阳性率高，且在新生儿中易出现假阴性，所以目前较少单纯用AchE染色来诊断HD。有报道称HE法和AchE染色两者结合可以更好诊断HD，但增加了大量操作步骤及时间，不利于术中快速诊断。至于LDH染色法，因能在神经节细胞中形成蓝紫色颗粒状淀物，有时候也能判断出无神经节细胞肠段的范围，但这种酶对神经节细胞及神经纤维缺乏特异性，而且一般要联合应用AchE染色，故不建议用于巨结肠的诊断。

发明内容

本发明只对现有技术存在的问题，旨在提供一种快速准确的染色方法，一种利用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶的化学染色方法。

本发明通过以下技术方案实现：

利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶NADPH-d组织的化学染色方法，其通过以下步骤完成：

1)制片标本常规冰冻连续切片，片厚4μm，多聚赖氨酸载玻片处理切片。

2)NADPH-d的快速组织学染色方法反应液组成：1mL0.1mol/L PB，pH8.0溶液中加入0.5mg NADPH-d、0.6mg氯化硝基四氮唑蓝NBT、10μL二甲基亚砜、3μL聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应液37℃提前预热，滴加反应液后载玻片置于37℃水浴箱中10min，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，伊红衬染10S，PBS冲洗，水性封片剂Clear mount封片，完全干燥后可用中性树胶再次封片。

3)双重染色NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5min，采集图像。

4)对数据进行统计学处理。

本发明的有益效果为：1)NADPH-d法流程简单，无需水化、脱水等流程，而仅需在37℃条件下反应，5～10min内即出结果；2)NADPH—d阳性切片经抗原修复后再用肠神经特异性单克隆TUJ-1验证，两者阳性神经丛及细胞分布一致，说明NADPH—d阳性神经节细胞即肠神经节细胞。

附图说明

图1是扩张段的NADPH-d的快速组织学染色；

图2是扩张段肌间神经丛及神经节细胞；

图3是狭窄段NADPH-d的快速组织学染色；

图4是狭窄阶段HE染色；

图5是扩张段NADPH-d阳性神经丛及神经节细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

材料与方法：