[发明专利]一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸诊断试剂技术领域，特别是一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒。

背景技术

曲霉菌是一种典型的丝状菌，在环境中广泛存在，主要通过呼吸道吸入霉菌孢子进入人体，首先侵入感染肺部进而引发肺曲霉菌病。在血液系统疾病、肺结核、慢性支气管炎、支气管扩张、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成为仅次于白念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成为最常见的、传播最广的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病死率高达30％～50％。传统的真菌分离、培养和组织病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、敏感、特异的诊断方法是目前条件性曲霉菌感染实验诊断研究领域的热点。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。

曲霉菌感染中最常见的是烟曲霉感染，但目前国内并没有检测烟曲霉的荧光PCR产品，更没有检测更大范围的多种曲霉菌荧光PCR检测产品。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种曲霉菌定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性工作标准品、检测反应液、红细胞裂解液、稀释液、DNA聚合酶，其特征在于：在阳性工作标准品、阴性工作标准品及检测反应液中均含有特异性引物与特异性探针，所述特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：

特异性引物正向序列SQ1：5’-AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互补链；

特异性引物反向序列SQ2：5’-AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互补链；

特异性探针序列SQ3：5’-FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’或其互补链。

而且，所述特异性引物与特异性探针根据曲霉菌ITS序列特性设计，针对曲霉菌ITS序列设计的引物和探针用于检测曲霉菌。

而且，在所述阳性工作标准品中含有插入烟曲霉特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插入序列SQ4如下：

SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc。

而且，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1.0×10³～1.0×10⁷。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。

2、本发明灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到曲霉的感染。

3、本发明检测速度快，加上样本处理总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样本检测。

4、根据多种曲霉菌ITS序列特性设计的引物和探针可以检出多种曲霉菌。

附图说明

图1为曲霉菌阳性反应液的荧光PCR扩增曲线和阴性反应液荧光PCR扩增曲线；