[发明专利]一种水痘病毒滴度快速检测方法在审

专利信息
申请号: 201410419594.X 申请日: 2014-08-25
公开(公告)号: CN104407147A 公开(公告)日: 2015-03-11
发明(设计)人: 高辉 申请(专利权)人: 北京合康源生物科技有限公司
主分类号: G01N33/68 分类号: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 101102 北京市通州区中关村科技园*** 国省代码: 北京;11
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 水痘 病毒 快速 检测 方法
【说明书】:

技术领域

发明属于生物技术领域,特别涉及一种水痘病毒滴度快速检测方法。

背景技术

水痘是一种常见、多发、有高度接触传播性的儿童急性传染病,15岁以下少儿家庭内接触感染率为61%~87%,少数研究报道家庭内接触感染率甚至可达92%~100%。由于儿童期水痘发病绝大多数症状轻微,过去常不被人们所重视,但患水痘后处理不当,会并发肺炎、脑炎等严重疾病,甚至死亡,且感染后潜伏在体内,激活后又可发生带状疱疹。我国儿童水痘的发病和危害日益凸显,接种水痘疫苗是目前控制水痘感染与流行的有效手段。

水痘病毒属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员。病毒颗粒呈球形,直径180nm~200nm,为椭圆形颗粒,由带有糖蛋白突起的脂质包膜和和一个含双链DNA基因组的核衣壳组成。病毒核衣壳是由162个壳微粒组成的对称20面体,壳外有一层或多层的含脂蛋白的包膜。包膜上的糖蛋白至少有8种:gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK及gM。糖蛋白主要存在于病毒囊膜和感染细胞的包膜中,与病毒的致病性和免疫原性有着密切关系。糖蛋白的结构和分子量都已清楚,病毒糖蛋白gE、gB、gC均能诱导机体产生中和抗体。gE的分子量最大,在病毒包膜上含量最高,是病毒主要抗原,也是制备病毒亚单位疫苗和DNA疫苗的主要候选抗原。糖蛋白gE(也称gp I),分子质量为60~98kDa,是水痘病毒囊膜和感染细胞膜上含量最丰富、抗原性最强的糖蛋白,具有典型的I型跨膜蛋白结构。

目前病毒滴度是表观水痘疫苗质量的主要指标,也是生产过程中水痘疫苗原液和成品的主要检测项目。滴度传统检测方法为蚀斑法(单层法),其操作步骤为:

(1)6孔板接种细胞将浓度105个/ml的细胞悬液,接种6孔板,每孔3ml,置25~45℃ CO2孵箱培养。一般3天,细胞长成单层,接种病毒。

(2)6孔板接种病毒将疫苗按适当比例用病毒释液稀释。将细胞长成单层的6孔板,吸去细胞生长液,加入稀释后的病毒液,0.1ml/孔,置25~45℃,CO2孵箱吸附90min,中间轻摇6孔板2~3次,吸附完毕后,加入细胞维持液,3ml/孔,置25~45℃,CO2孵箱培养。7天后染色,判定结果。

水痘带状疱疹病毒极不稳定,不能在结痂或污染物中长期存活。病毒感染也仅限于很窄的pH范围,pH<6.2或pH>7.8时即丧失感染性。水痘病毒对温度同样敏感,无稳定剂的条件下很快丧失感染性。目前一般水痘疫苗生产企业需要获得原液后,-80℃冻存,待滴度检测结果出来以后再进行配制冻干。期间需要等待至少7天时间。

因此,目前急需一种能够快速、灵敏检测水痘病毒滴度的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速、灵敏检测水痘病毒滴度的方法。所述检测方法利用水痘病毒感染单层细胞初期,在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白,通过免疫反应的方法,确定感染病灶,在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的:

一种水痘病毒滴度快速检测方法,所述检测方法利用水痘病毒感染单层细胞初期,在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白,通过免疫反应的方法,确定感染病灶,在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度;

所述检测方法包括以下步骤:

1)病毒接种

取人正常胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞),铺满96孔板单层,将待测水痘病毒样品做梯度稀释,取2~4孔为一组,每组加同一浓度所述水痘病毒稀释液25ul,同时做平行孔和阴性对照孔,轻轻摇动平板使所述水痘病毒均匀地分布,25~45℃,吸附30~90分钟,弃去孔内液体,加入甲基纤维素溶液,25~45℃孵育43~47小时;

2)滴度测定

向经过上述经病毒接种的每孔以及平行孔和阴性对照孔内,加入新配制预冷甲醛丙酮缓冲液,室温放置5~20分钟,弃去孔内液体,在吸水纸上拍干,每孔加入洗液,洗涤1~5次,再加入普通山羊血清封闭,室温放置2~8分钟,弃去液体,轻轻拍干,加入小鼠抗水痘病毒包膜糖蛋白单克隆抗体,25~45℃孵育20~40分钟,弃去孔内液体,在吸水纸纸上轻拍,洗涤1~5次,加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体,在25~45℃孵育20~40分钟,弃去孔内液体,在吸水纸纸上轻拍,洗涤1~5次,加入TMB显色底物,并在室温下避光孵育1~4小时;

3)滴度计算

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于北京合康源生物科技有限公司,未经北京合康源生物科技有限公司许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201410419594.X/2.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top