[发明专利]用于检测肝癌与肝硬化相关多肽-蛋白组合式标志物的双抗体夹心试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于检测肝癌与肝硬化相关“多肽-蛋白组合式标志物“的双抗体夹心酶联免疫吸附法或化学发光法试剂盒。 

背景技术

我国是肝癌发生率高的国家，发病率占全球55％，且呈年轻化的趋势；全国每年由此导致各种肝病的死亡人数超过30多万，死亡率占全球45％。肝癌已成为死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。多种损肝因素引起的肝脏损害和炎症是肝纤维化、肝硬化的病理学基础，“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的途径是肝癌发展的必经过程。尽管对于肝硬化转为肝癌几率的报道不尽相同，多数研究仍将肝硬化作为肝癌发生的最大风险因素。80％左右的肝癌患者伴随有肝硬化或晚期肝纤维化。因此要做到肝癌和肝硬化的早期发现、早期诊断、早期治疗，在肝硬化阶段即进行介入预防，将有效降低肝硬化转向肝癌的发生率及死亡率。 

对于肝癌和肝硬化的诊断方法主要包括病理学、影像学和血清学诊断3种。其中，肝组织活检是诊断肝癌和肝硬化最为常用的检验金标准，但作为一种侵入性检查，其并发症的发生率为1％～5％，死亡率为1/10000～1/1000。肝穿刺盲目性大、取材不够、肝脏病变的不均一，均会导致取样误差，不能反复取材进行动态观察。患者心理承受能力也限制该微创检查。常用的无创性诊断方法有影像学诊断及血清学诊断，其中，影像学诊断主要是B超和CT，这些方法在检测伴有门静脉高压的晚期肝纤维化时，具有较高的灵敏度和特异性，但用于诊断早期肝癌和肝硬化的敏感性却不强，因此，通过检测血清标志物，观察并辅助判断肝癌和肝硬化，将具有很重要的临床意义。临床常用的肝癌和肝硬化血清标志物包括甲胎蛋白(AFP)和胆碱酯酶(CHE)，但各有其局限性，主要表现为灵敏度仍然偏低。 

相关研究表明，肿瘤在癌变过程中，细胞蛋白质和酶的增殖不但使血清蛋白变化，也影响到血清多肽。2006年Villanueva J的研究发现了61种具有癌症特征的肽段标志物和不同蛋白酶活性之间存在着直接关联，认为血清多肽 组蕴含蛋白降解模式，携带具有重要临床价值的标志物信息，血清多肽比蛋白能更精细地区分某些肿瘤差异，血清多肽可能会识别其他标志物无法识别的肿瘤，并且指出几种肽段模式在临床上有望作为肿瘤的标志物，对前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的诊断有一定研究意义。2002年以来，血清多肽已成功应用于多种肿瘤的诊断研究，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、淋巴癌、脑胶质细胞瘤等。Petricoin等利用生物信息学手段对血清多肽图的组成等模式进行分析，成功地对早期卵巢癌进行了诊断，敏感性、特异性和阳性预测值分别为100％，95％和94％，显著优于传统的CAl25检测，特别是对早期卵巢癌(I期)的诊断也十分成功。 

血清多肽与蛋白标志物在ELISA检测方法上仍存在诸多不足，尤其是多肽与蛋白标志物的联合检测尚处于简单的“混合型”模式。ELISA检测方法中，最常使用双抗体夹心ELISA，该方法在血清多肽和蛋白进行联合检测的研究中，一般将几种相关的，甚至无关联的蛋白或多肽标志物分别检测，可靠性大打折扣。Sogawa报道了采用肝纤维化多肽标志物FIC5.9的N端和C端来制备不同抗原表位的特异性多肽抗体，并形成了多肽标志物的双抗体夹心ELISA检测方法，具备一定的创新思维，但对于多数已经报道的潜在肿瘤多肽标志物来讲，一般分子量较小，尤其对于2kDa以下的小分子多肽，存在肽链短小、免疫原性弱等局限，难以通过抗N端表位、C端表位或中间表位的办法来建立双抗体夹心检测。 

激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)对于细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生和血管的生成有着重要作用。KKS是一种内源性的多蛋白体系，高分子量激肽原(HK)是其代谢通路中的一个典型蛋白，它以糖蛋白形式存在于血浆中，分子量120kDa，该分子可划分为6个结构域(D1-D6)。D1、D2和D3区组成重链；D3后是1个小区段D4，含有缓激肽片段；D5和D6区组成分子的轻链。HK在Lys362-Lys363和Arg371-Ser372之间被激活后，释放D4区缓激肽BK，产生HKa。HKa由含D1、D2和D3的重链和含D5和D6的轻链组成，重链和轻链由1个二硫键连接起来。HK转变为HKa后，发生结构重排、构象变化等使D5区暴露更加明显，从而发挥更好的生物学作用。Alvin H.Schmaier等认为HKa可以通过与内皮细胞结合抑制新血管的生成来阻止肿 瘤的形成，同时HKa还可以通过阻断EGFR与uPAR的结合来抑制肿瘤的转移和侵袭。