[发明专利]一种用于系统性红斑狼疮的基因诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种自身免疫病的基因诊断试剂盒，更具体的说是一种用于系统性红斑狼疮的基因诊断试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

自身免疫性病是一类被忽略的，常见的致死致残的慢性疾病。系统性红斑狼疮(systemicIupuserythematosus，SLE)被认为是自身免疫病的原型疾病，可累及身体任何器官。SLE的诊断目前主要依据美国风湿病学会1982年制定以及1997年修订的分类标准，2009年系统性红斑狼疮国际协作组(SLICC)又对其进行了更新。但这些SLE分类标准均以从自身免疫性疾病病谱中将SLE分离出为主要目的，不利于鉴别或发现轻型SLE和早期SLE。而对于SLE来说，延误治疗是导致死亡的独立危险因素，提示早期诊断对患者预后至关重要。

当前已有很多尝试应用生物标记来帮助诊断SLE的研究，但由于疾病的高度异质性，多数均告失败。近十年来，随着分子生物学的进展，人们发现I型干扰素在SLE患者中水平增高，该通路基因多态性位点也与疾病相关，并且在人类和动物中I型干扰素治疗可诱导产生狼疮样表现，说明干扰素诱导基因在疾病发生中起重要作用。在本发明作出之前，已有尝试将干扰素诱导基因应用于临床，不过几乎所有的研究均致力于进行SLE疾病活动性判断，包括早期研究也显示干扰素诱导基因表达水平确实与疾病活动评分及一些特定临床表现相关。但是，之后的长期随访观察显示，干扰素诱导基因表达水平并不随疾病活动性变化而改变，提示SLE体内I型干扰素的异常可能是疾病所固有的，从而对诊断更有帮助。

I型干扰素诱导基因已报道与SLE相关的至少有几十个，其中一些也与其他自身免疫病(如类风湿关节炎、干燥综合征、炎性疾病等)有关，缺乏特异性。我们前期先从14个主要基因中通过因子分析筛出5个最具代表性的基因，再与正常人及其他免疫病患者对比，分析其在SLE诊断中的价值。其后尝试检测5个干扰素诱导基因表达，发现对系统性红斑狼疮有一定诊断价值，但一方面检测基因数多，费时费力且增加消耗；另一方面经过受试者工作特征曲线分析，其中两个并不对诊断起较大作用。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种用于系统性红斑狼疮的基因诊断试剂盒。

本发明的技术方案是：

一种系统性红斑狼疮的基因诊断试剂盒，其主要技术特征在于，包括有用于扩增OASL、IGS15和LY6E这3个基因的引物，还包括看家基因RPLPO的引物，以及扩增试剂。

所述各基因引物序列分别为：

OASL-F：5’-CCATCACGGTCACCATTGTG-3’

OASL-R：5’-ACCGCAGGCCTTGATCAG-3’

ISG15-F：5’-GGTGGACAAATGCGACGAA-3’

ISG15-R：5’-CAGCCCGCTCACTTGCT-3’

LY6E-F：5’-ACTGCGTGACTGTGTCTGCTA-3’

LY6E-R：5’-AGGCTGTGGCCAAATGTC-3’

RPLPO-F：5’-GTTTCATTGTGGGAGCAGACA-3’

RPLPO-R：5’-CATGGTGTTCTTGCCCATCA-3’

所述扩增试剂包括预混有PCR缓冲液和dNTPs的热启动Taq酶、ROX惰性参比染料和超纯水。

所述扩增试剂由以下体积的组分组成：cDNA1.0μl，PremixExTaqTM(2×)10μl，ROX惰性参比染料(50×)0.4μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，超纯水7.8μl。

所述通过实时定量PCR技术检测LY6E、IGS15、OASL的表达，取3次检测值的平均数计算荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，减去看家基因RPLPO到达阈值时的循环数值计算出差异值，再通过2^-差异值计算各基因相对表达值。

所述通过计算改良干扰素指数进行结果判断，以待测样品基因相对表达值-正常组平均基因相对表达值，再除以正常组基因表达标准差，计算出单个基因干扰素指数，将对应于LY6E、ISG15和OASL的三个值相加，即为改良干扰素指数。

所述在改良干扰素指数为2.37时，其诊断的敏感性和特异性达到最佳界值，分别为70％和80％。