[发明专利]一种高特异性检测样品中靶DNA的方法及应用

权利要求书

1.一种高特异性检测样品中靶DNA的方法，其包括如下步骤：

A)预处理步骤：利用预处理液对固定有靶DNA的固相支持物表面进行预处理；

B)前处理步骤：利用前处理液对所述固相支持物表面进行前处理；

C)一步反应步骤：将所述靶DNA在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与至少一种生物素标记的DNA探针进行一步反应；

D)后处理步骤：步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述固相支持物表面进行后处理；

E)显色反应步骤：将所述固相支持物置于底物溶液中进行显色反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为5ng/ml～50ng/ml，优选为10ng/ml～40ng/ml，更优选为15ng/ml～30ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述生物素标记的DNA探针在杂交液中的浓度为0.1pmol/ml～5pmol/ml，优选为0.2pmol/ml～2pmol/ml，更优选为0.25pmol/ml～1pmol/ml。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述预处理液包括封闭剂和非离子型表面活性剂；其中，所述封闭剂为酪蛋白和/或牛血清白蛋白，所述非离子型表面活性剂为吐温和/或曲拉通；在所述预处理液中，封闭剂占预处理液的1～5％(w/v)，非离子型表面活性剂占预处理液的0.05％～1％(v/v)；优选地，封闭剂占预处理液的2～4％(w/v)，非离子型表面活性剂占预处理液的0.05％～0.2％(v/v)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述预处理液还包括阴离子型分散剂和阴离子型聚丙烯酰胺；其中，所述阴离子型分散剂选自木质素磺酸盐，优选木质素磺酸钠；在所述预处理液中，阴离子型分散剂占预处理液的0.05％～0.2％(w/v)，阴离子型聚丙烯酰胺占预处理液的0.02-0.5％(w/v)；优选地，阴离子型分散剂占预处理液的0.1％～0.2％(w/v)，阴离子型聚丙烯酰胺占预处理液的0.1-0.3％(w/v)。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述预处理液的PH为7.0～8.0。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述前处理液为PH7.5～9.0的缓冲溶液，所述缓冲溶液选自巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液和硼酸-硼砂缓冲溶液。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液质量的0.1～5％(w/v)，优选0.5～2％(w/v)。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液的PH为9.0～10.0。

10.根据权利要求1～9中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述预处理是将所述固相支持物浸泡在温度为37℃～42℃的所述预处理液中20min～50min。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述杂交液包括锌离子、镁离子、非离子型表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述非离子型表面活性剂为吐温和/或曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

12.根据权利要求1～11中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，非离子型表面活性剂占杂交液的0.1～0.5％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.1％(w/v)；优选地，锌离子为0.004～0.05mol/L，镁离子为0.004～0.05mol/L，非离子型表面活性剂占杂交液的0.2～0.4％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.02～0.06％(w/v)。