[发明专利]一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，我国水体污染日趋严重，严重威胁着人们的生存环境和健康用水，并对社会造成了严重的经济损失。随着太湖流域养殖业的迅猛发展，养殖业废水已成为该流域水体污染的主要来源之一，2011年太湖流域畜禽养殖业巨大，其中生猪约400万头，预计到2015年养殖量还将上升5％。生猪养殖产生大量粪便污染物未经处理便直接排放到环境中，造成了极大的污染。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成富营养化，并且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播。进行水体污染的控制和治理已经刻不容缓。

粪便污染的潜在污染源种类繁多，呈现面源特征，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只停留在“见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分水体中粪便污染主要来源，从而快速、准确地确定污染源，成为了解决问题的关键。传统方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。2000年，Pierre等最先证实粪便中的线粒体DNA(mtDNA)具有其种属特异性，并且动物粪便中含有较高丰度的mtDNA，通过PCR手段能够检测到明显的mtDNA信号，因此提出了“水体粪便污染的mtDNA溯源方法”。

以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。通过特异性引物PCR扩增水体中的目标线粒体DNA片段，即可检测样品是否受到潜在的粪便污染，用时短且准确度高。另外通过设计特异性的巢式PCR引物进行二次扩增，极大的提高了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量粪便污染。

目前国内对水体粪便污染溯源研究较少，本发明基于猪mtDNA设计的一组特异性巢式PCR引物及实验方法能够快速、准确地检测水体中的微量猪粪污染，国内外均未见报道。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的水体中猪粪污染检测困难、灵敏度不高问题，本发明提供了一种检测水体猪粪污染的PCR试剂盒及检测方法，它可以实现快速、准确地检测水体中的微量猪粪污染。

2.技术方案

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒，包括4种巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂O，4种巢式PCR引物为：

SPF1：5’-CTACTCATACCCAGCAAGCC-3’

SPR1：5’-TAGGAATTAATAGGGCGGGTG-3’

NPF1：5’-TACCCAGCAAGCCCAGAATC-3’

NPR1：5’-GATTGTGCGGTTATTAATGAGTCGTT-3’。

更进一步的，PCR buffer为10×PCR buffer。

更进一步的，巢式PCR引物SPF1、SPR1的检测阈值为0.254ng/ul猪粪DNA，巢式PCR引物NPF1、NPR1的检测阈值为0.008ng/ul猪粪DNA。

一种PCR试剂盒检测污染水体中猪粪的检测方法，其步骤为：

(1)从待测水样中提取DNA作为模板；

(2)进行第一轮PCR扩增，2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SPF1、SPR1；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；

反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存；

(3)检验PCR扩增产物：5ul PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，若存在490bp的条带，表明水体受到了猪粪污染，若不存在，则进行下一步骤；