[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的人副流感病毒快速检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人副流感病毒抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

人副流感病毒(humanparainfluenzavirus，HPIV)是儿童急性呼吸道感染的重要病原体，主要经飞沫传染，亦可通过眼、口或鼻的粘膜接触进行传播，发病率以婴幼儿最高。人副流感病毒感染呈全球性分布，是常见的社区获得性呼吸道感染的病原，人副流感病毒感染在小儿儿童急性呼吸道感染的发生率高达30-40％，其是导致小儿下呼吸道严重感染的、仅次于呼吸道合胞病毒的病原体。该病原体首先发现于上世纪50年代末，原名仙台病毒，最初从日本仙台市一例死于肺炎的患儿肺液中分离出来。根据遗传学和血清学可分为4型，而1-3型在临床中最为常见,每种亚型主要的结构和生物学特征相似，但流行病学和所引发疾病的临床特征有差异。副流感病毒1，2型所导致的相关疾病主要有义膜性喉炎、上呼吸道和下呼吸道感染；3型主要导致细支气管炎及肺炎；4型在临床上不多见，一般仅导致轻微感染。

临床病人由于不同的呼吸道病原体(如副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了人副流感病毒的流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。

尽管人副流感病毒在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，人副流感病毒的检测主要有以下几种方法：

一、常规实验室检测

1、病毒分离

实验室诊断人副流感病毒的金标准是分离人副流感病毒毒株。采用鼻咽分泌物作为病毒分离的标本，可以用LCC-MK2细胞培养的方法分离病毒。但是该法有严重的缺陷，因为它费时费力，通常需要一周才能得到最终结果，这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。

2、血清学检测

即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中人副流感病毒抗体水平，可间接提示人副流感病毒感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人副流感病毒抗体效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在人副流感病毒特异性抗体的差异，并且，据报道患儿IgM的检出率大约只有50％，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。

二、快速诊断

直接检查人副流感病毒蛋白抗原和病毒核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2h以上)，成本较高等缺点。PCR方法快速、灵敏、特异，是目前研究人副流感病毒感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立具备超高灵敏度的人副流感病毒特异性抗原快速诊断法十分必要。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人副流感病毒抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人副流感病毒抗原的方法，其特征在于：所述该方法包括以下步骤：

1)兔抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的制备；

2)鼠抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的制备；

3)将步骤1)制备的兔抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体分别与纳米磁珠通过共价偶联，分别制备抗I、II及III型人副流感病毒免疫纳米磁珠，将上述三种免疫纳米磁珠等量混合即制得抗人副流感病毒免疫纳米磁珠；

4)将步骤2)制备的鼠抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体分别与纳米量子点通过共价偶联，分别制备量子点标记的抗I、II及III型人副流感病毒纳米探针，将上述三种纳米探针等量混合即制得量子点标记的抗人副流感病毒纳米探针；