[发明专利]基于磁性分离和多色量子点标记的抗人肺炎链球菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和多色量子点标记的抗人肺炎链球菌IgM、IgG抗体快速共检的检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

人肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为严重。肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。其荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。肺炎链球菌菌体抗原主要为C多糖，其存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反应蛋白沉淀。在钙离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白(C reactive protein，CRP)的β球蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测亦主要是针对此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。在肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于肺炎链球菌所有血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。但是PspA分子结构高度变异，具有抗原多样性，其富含脯氨酸的结构域上游被称为CDR域，具有多样性。根据CDR域的不同将PspA分为3个家族6亚类：Clade1，Clade2，Clade3，Clade4，Clade5，Clade6。其中Clade1，Clade2属于Fam1家族；Clade3，Clade4，Clade5属于Fam2家族，Clade6属于Fam3家族。具有Fam1或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的人肺炎链球菌种类的99％以上。我国目前还未见具有fam3家族PspA蛋白的肺炎链球菌的临床分离报道。研究表明同一家族亚类间PspA蛋白间存在广泛的抗原抗体交叉反应，而异家族亚类间则无此交叉反应。

临床病人由于不同的呼吸道病原体(如副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。

在人肺炎链球菌感染的实验室诊断上，被检者血清中抗肺炎链球菌抗体指标则是诊断结果的重要依据之一。

免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是人体内最重要的两种抗体。当人肺炎链球菌进入机体后，最早出现的免疫球蛋白是IgM抗体，之后出现IgG，通过检测体内特异性IgM、IgG抗体的存在，可诊断人体对人肺炎链球菌的免疫反应状态。若检测出特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM抗体半衰期较短，IgM的检测阴性并不能证明机体未受感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的IgG抗体，以明确诊断。

目前，血清中特异性IgM及IgG抗体的检测方法主要有冷凝集实验、明胶颗粒凝集实验、酶联免疫吸附实验、金标免疫斑点法及金标免疫层析法。冷凝集实验的特异度和敏感度均为最低，因此其临床诊断价值不大；金标免疫斑点法及金标免疫层析法虽操作简便快捷，但敏感度略低，对抗体水平较低的患者有漏诊的可能；明胶凝集实验试剂准备与操作过程较为繁琐，且需要专业操作人员。酶联免疫吸附法具有特异、敏感等优点，已用于检查各种抗体或抗原，但此方法存在以下问题：(1)每一批试验从加样、温浴、洗版等步骤较多，操作繁琐，时间较长(总共需要2-4小时)；(2)检测中需分别加入显色成分A液与B液，且还要在规定时间内完成读数，一定程度上增加了劳动强度和操作失误的可能性；(3)该法无法做到对IgM及IgG两种抗体的同时检测。虽然单独检测IgM和IgG抗体后，再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响，但操作过程繁琐，检测不够方便快捷，检测成本较共检亦会增加。

因此，建立具备高灵敏度、能对抗人肺炎链球菌的特异性IgM、IgG抗体进行快速同步共检的检测方法显得十分必要。

发明内容