[发明专利]一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学成像系统及方法，特别是关于一种基于联合生物标记的超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法。

背景技术

超分辨光学显微技术利用对荧光发射在空间或时间上的调制，实现了突破光学衍射极限的显微成像。超分辨光学闪烁显微成像技术(SOFI)通过荧光团自身发射荧光在时间上的闪烁特性，计算不同荧光团所发射的荧光信号的时间自相关或空间互相关函数，获得空间分辨率的提升。在传统的超分辨光学闪烁显微成像中，分辨率提高的多少与所计算的互相关累积量的阶数有关，阶数越高，所得到的分辨率提升也会越多。此外，荧光团生物标记密度的高低直接影响到重建的生物结构的连续性和完整性，但是，随着互相关累积量阶数的增加，高标记密度的图像重建会诱发严重的伪影，导致最终图像出现明显的残缺和不连续的结构，降低了成像的质量，这一数学问题限制了高阶闪烁显微成像在生命科学研究中的应用。

现有的方法只能通过适当降低生物标记的密度来减少高阶闪烁显微成像所诱发的伪影，但降低标记密度所带来的问题是会造成生物结构标记不完整，难以真实、完整地反映所研究的生物结构的细节信息。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于联合生物标记的超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统及方法，该方法能够有效降低在超高标记密度下高阶闪烁显微成像的伪影，更加真实地还原出所研究的生物样品的完整结构和细节信息。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统，其特征在于，它包括：一激发光源，用以提供一束激发光；一第一会聚透镜，对来自所述激发光源的所述激发光进行聚光，并且来自所述激发光源的所述激发光穿透所述第一会聚透镜；一第一二向色镜，反射来自所述第一会聚透镜的所述激发光；一物镜，透射来自所述第一二向色镜的所述激发光；一载物台，其上设置有生物样品，并且来自所述物镜的所述激发光照射在所述生物样品上，所述生物样品在来自所述物镜的所述激发光的激发下会发射荧光，所述荧光通过所述物镜发射到所述第一二向色镜，所述第一二向色镜透射来自所述物镜的所述荧光；一第二二向色镜，对来自所述第一二向色镜的所述荧光进行分光，一部分来自所述第一二向色镜的所述荧光被所述第二二向色镜反射，另一部分来自所述第一二向色镜的所述荧光被所述第二二向色镜透射；一第二会聚透镜，对被所述第二二向色镜反射的所述荧光进行聚光，并且来自所述第二二向色镜的所述荧光穿透所述第二会聚透镜；一第一CCD相机，用于对来自所述第二会聚透镜的所述荧光进行成像；一第三二向色镜，对被所述第二二向色镜透射的所述荧光进行分光，一部分来自所述第二二向色镜的所述荧光被所述第三二向色镜反射，另一部分来自所述第二二向色镜的所述荧光被所述第三二向色镜透射；一第三会聚透镜，对被所述第三二向色镜反射的所述荧光进行聚光，并且来自所述第三二向色镜的所述荧光穿透所述第三会聚透镜；一第二CCD相机，用于对来自所述第三会聚透镜的所述荧光进行成像；一第四会聚透镜，对被所述第三二向色镜透射的所述荧光进行聚光，并且来自所述第三二向色镜的所述荧光穿透所述第四会聚透镜；以及一第三CCD相机，用于对来自所述第四会聚透镜的所述荧光进行成像。

所述第一CCD相机、第二CCD相机和第三CCD相机具有相同的像素数，并且单个像素大小相同。

一种超高密度超分辨光学闪烁显微成像方法，包括以下步骤：1)使用三种不同荧光发射波长的量子点联合标记生物样品中的同一细胞结构；2)将经过标记的生物样品放置并固定在超高密度超分辨光学闪烁显微成像系统的载物台上；3)调节物镜与生物样品之间的距离，使生物样品位于物镜的焦点上，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4)开启激发光源器，调节激发光的输出功率，并同时通过多个数字成像设备观察采集到的荧光图像，当观察到明显的荧光强度闪烁现象时，稳定激发光的输出功率；5)用多个数字成像设备同时采集三种量子点独立发射的荧光信号；6)对采集的三个通道的图像时间序列分别使用高精度的漂移校正算法进行漂移校正；7)用经平衡补偿后的超分辨闪烁显微成像算法对漂移校正后的三个通道的闪烁荧光图像进行分别处理；8)将处理后的三个通道的超分辨图像进行合并融合，即可得到生物样品的超高分辨率、高保真度的图像。

所述第一二向色镜选用能够反射来自所述第一会聚透镜的激发光并且透射所标记的三种量子点发射的荧光的波长；所述第二二向色镜选用能够反射其中一种量子点的荧光并且透射另外两种量子点的荧光的波长；所述第三二向色镜选用能够反射所述第二二向色镜所透射的两种量子点中一种量子点的荧光且透射另外一种量子点的荧光的波长。