[发明专利]杂交瘤细胞株FQ-Aa6及其产生的抗重金属镉单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株FQ-Aa6，及其分泌的抗重金属镉离子的单克隆抗体。

背景技术

随着现代工业的快速发展，给人类生活带来极大方便的同时也造成了环境的严重污染，包括重金属污染。环境中重金属镉的主要污染来源包括：铅锌矿的开采、选矿和冶炼过程中产生的废水和废气；合金钢的生产和加工过程；电镀镉的生产废水，染料、农药、油漆、玻璃、陶瓷、照相材料等生产和加工过程。镉在环境中的残留通过食物链逐渐富集，极微量的镉就可以对人体造成危害。1993年世界肿瘤研究机构已将镉定义为人类致癌物(group I)，镉对环境的污染已引起普遍关注。因此对环境中重金属镉的检测工作越来越受到人们的关注。

目前，重金属的检测多采用原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱法、离子色谱仪、X射线荧光光谱法、气相色谱一质谱联用法等化学仪器方法。这些传统的检测方法虽具有较高的精确度与准确度，但检测仪器昂贵，检测相对费力、费时，且检测工作往往需要相对稳定的实验室环境，不适应现实中对快速简便检测的需求。

重金属的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，便携而有利于进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。但重金属离子本身免疫原型低，很难制备出针对重金属离子的单克隆抗体。因此，为克服该困难，本发明通过化学合成高选择性重金属离子捕获螯合剂，制备重金属离子螯合物，与载体蛋白偶联获得完全抗原，筛选出能够分泌针对环境水中重金属镉离子的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并利用该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体建立了针对环境水中重金属镉离子的酶联免疫检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供杂交瘤细胞株FQ-Aa6，及其分泌的抗重金属镉离子的单克隆抗体。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

1)抗原制备：

分别称取血蓝蛋白和牛血清白蛋白10mg溶于0.5mL，浓度为10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成血蓝蛋白和牛血清白蛋白溶液；

称取10mg金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶于1mL二甲基亚砜中形成23nM金属螯合剂溶液；

分别取78.1μL浓度为23nM的金属螯合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mL血蓝蛋白和牛血清白蛋白溶液中，用10MKOH调节pH至9.0，室温下反应24小时；

反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液冲洗3次，再用10mM，pH7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液洗2次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即分别为纯化的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸和牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液，将牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液等分成两份，一份直接用作包被抗原，另一份与金属镉离子螯合；

53.7mg纯度为99.999％的镉粒溶于100μL优级浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成477.8mM镉溶液；

取18.8μL浓度为477.8mM的镉溶液搅拌下逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸中，取8.9μL浓度为477.8mM的镉溶液搅拌下逐滴滴加到纯化过的牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时。用30Kd的超滤管进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cd和牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cd。其中血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cd为免疫原，牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cd为包被源。

2)小鼠免疫

将制备好的免疫原免疫6-8周龄雌性BAIB/C小鼠，每次每只小鼠的免疫原用量为200μg(以蛋白含量计算)，共免疫五次。从第四次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血，用间接非竞争ELISA法检测抗体的效价与特异性。

3)细胞融合