[发明专利]牡丹花粉蛋白多肽，及制备方法和应用

权利要求书

1.一种牡丹花粉蛋白多肽的制备方法，其特征在于，以干燥的牡丹花粉为原料制备而成，所述方法包括将牡丹花粉经过花粉破壁、粗蛋白提取、真空干燥，得到牡丹花粉蛋白，并进一步将牡丹花粉蛋白经过蛋白酶解、脱苦脱色、离心或过滤，得到牡丹花粉多肽，其中，所述的花粉破壁为超微化破壁、或旋风粉碎法破壁，所述超微化破壁，在于将牡丹花粉用行星球磨机超微化破壁，转速 400-600r/min，粉碎时间为0.5-1.5h，球料比为6.8-7；所述旋风粉碎法破壁，在于采用旋风粉碎法，将牡丹花粉放入旋风式高速样品粉碎机中粉碎1-5min，其中，所述粗蛋白提取包括（1）水溶蛋白提取步骤，所述水溶蛋白提取步骤，在于将破壁后的花粉，按料水比1：10-20加入蒸馏水，4-60℃搅拌提取1-8h，并经4000-8000r/min离心10-20min后收集上清液，残留物备用，在上清液中逐级加入一定量固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度依次达到40%、60%、80%，每次充分搅拌1h，4000-8000r/min离心10-20min后，收集各级沉淀，用pH5.0-7.0的磷酸盐缓冲液溶解，然后用截留分子质量为100KDa的超滤膜进行超滤，得到水溶粗蛋白溶液；（2）盐溶蛋白提取，在于将上述水溶液提取后的残留物，按料液比1：10-20加入0.15-0.50mol/L氯化钠溶液，4-60℃搅拌提取1-8h，并经4000-8000r/min离心10-20min后收集上清液，残留物备用，在上清液中加入一定量固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到40%，充分搅拌1h，4000-8000r/min离心10-20min后，收集沉淀，用上述同等浓度的氯化钠溶液溶解，然后用截留分子质量为100KDa的超滤膜进行超滤，得到盐溶粗蛋白溶液；（3）醇溶蛋白提取，在于将上述氯化钠溶液提取后的残留物，按料液比1：10-20加入75%乙醇溶液，4-60℃搅拌提取1-8h，并经4000-8000r/min离心10-20min后收集上清液，残留物备用，在上清液中按料水比1：20-30加入蒸馏水，充分搅拌1h，4000-8000r/min离心10-20min后，收集沉淀，用75%乙醇溶解，4℃下用蒸馏水透析24h后，得到醇溶粗蛋白沉淀；（4）碱溶蛋白提取，在于将上述乙醇溶液提取后的残留物，按料液比1：10-20加入0.10-0.75mol/L NaOH溶液，4-60℃搅拌提取1-8h，并经4000-8000r/min离心10-20min后收集上清液，在上清液中加入一定量固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到40%，充分搅拌1h，4000-8000r/min离心10-20min后，收集沉淀，用上述同等浓度的NaOH溶解，然后用截留分子质量为100KDa的超滤膜进行超滤，得到碱溶粗蛋白溶液；其中真空干燥，在于将上述水溶粗蛋白溶液、盐溶粗蛋白溶液、醇溶粗蛋白沉淀、碱溶粗蛋白溶液，分别真空冷冻干燥，在-55℃~-40℃温度下，得到牡丹花粉水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白；所述牡丹花粉蛋白，是牡丹花粉水溶蛋白、牡丹花粉盐溶蛋白、牡丹花粉醇溶蛋白、牡丹花粉碱溶蛋白四种蛋白混合。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牡丹花粉来源于凤丹牡丹或者紫斑牡丹。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法在离心或过滤后还包括超滤膜精炼的步骤。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法在精炼后还包括干燥、灭菌的步骤。

5.如权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶选自木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或者几种。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶，或者风味蛋白酶与中性蛋白酶的组合，或者碱性蛋白酶与中性蛋白酶的组合，或者碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的组合。

7.如权利要求3-4任一所述的制备方法，其特征在于，所述超滤膜精炼步骤为将离心或者过滤得到的牡丹花粉多肽液体用超滤膜按分子量进行分级分离，得到不同分子量牡丹花粉多肽溶液，截留分子量为10KDa以下。