[发明专利]一种人干扰素IFN-α2b与LL-37的融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域

背景技术

蛋白的结构常常可以容许包括整个结构域的插入与融合，在自然界中，通过结构域的插入与融合从而形成大的多功能蛋白是一种较为普遍存在的现象。重组DNA技术的应用使得不同基因或基因片段的融合可以比较方便地进行，融合的基因经表达后即可得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白，这是一种极具潜在应用价值与理论意义的方法。目前这种方法已被广泛应用于许多领域的研究中，并已显示出较高的价值。基因融合技术最早即是被用来在细菌(主要是大肠杆菌)中表达外源蛋白，对于外源基因，利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点，一是由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易。其二是外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如β一半乳糖普酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。除此之外，利用融合蛋白的形式表达外源基因产物还有以下的一些特殊的优点，包括：通过融合表达为蛋白纯化提供便利；通过融合表达的方式促使产物以包涵体的形式表达等。故本发明将人干扰素-α2b和人LL-37融合。

IFN-α2b是由165个氨基酸组成的单链多肽，Cys¹和Cys⁹⁸，Cys²⁹和Cys¹³⁸组成二条二硫键。人LL-37全长37个氨基酸，分子内无二硫键，其N端丝氨酸被乙酞化，但缺少乙酞化对其活性影响不大。由于基因工程菌的重组人LL-37无法实现乙酞化，为此考虑将人LL-37置于融合蛋白的C端。因此如何设计一个适合连接肽是该分子设计的关键。若连接肽太长，两个药物的协同作用可能减弱，若太短，可能影响到干扰素α2b与受体的结合，只有适宜的连接肽不仅将两个药物连接成一个大分子，而且不会影响到两个药物保持各自的功能。该融合蛋白采用十几个氨基酸残基的连接肽，使得两个药物不仅较好地保持各自的功能，而且具有协同效果。

发明内容

1.人LL-37与IFN-α2bDNA序列的密码子优化

在保证人LL-37与IFN-α2b氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris对密码子的偏好性特点，对他们的DNA序列进行优化。

2重组人干扰素α2b和人LL-37融合蛋白表达载体构建

分别用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K和pMD-18Fall-IFN质粒，经凝胶电泳后切胶分别回收约9300bp和600bp的片断，用胶回收试剂盒回收片断，并用T4ligase连接，构建分泌型重组质粒pPIC9K-Fall-IFN，用CaCl法转化大肠杆菌DH5α，利用LB-Amp平板筛选重组子。挑选阳性转化子送上海生工进行测序，确定质粒的结构。

3重组质粒转化毕赤酵母

用SacI单酶切pPIC9K-Fall-IFN成线性重组质粒，通过电击转化法将其转入P.pastorisGS115中构建重组菌P.pastorisGS115LI。电击条件为1500kV，200Ω，25μF。转化液涂布于MD平板30℃静止培养3天，挑选阳性克隆，摇瓶后，用真菌基因组提取试剂盒提取基因组进行PCR鉴定。引物为：SenseP1：ATGTGTGACCTACCACAAACCCACA，AntisP2：GGACTCTGTCCTGGGTACAAGATT，退火温度为58℃，以GS115基因组及未加模板的体系为对照组。

4重组菌表型鉴定及多拷贝筛选

通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将PCR鉴定的阳性转化子编号，并将每菌株用灭菌牙签同时接种MD和MM平板，30℃静止培养5天，观察各菌株在两种平板上的生长情况。

通过遗传霉素(G418)浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的YPD平板，然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭菌牙签点在5个遗传霉素梯度平极上，30℃静止培养4天，观察结果，能在高浓度下生长良好的菌株为多拷贝菌株。

5融合蛋白发酵与纯化