[发明专利]一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系

说明书

本发明涉及一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。本发明提供了一种内皮祖细胞的高效扩增培养方法，使得CD34⁺单个核细胞在保持其原来干性特征的基础上实现有效和大量的扩增，本发明人还优化了内皮生长因子组合贴壁培养技术，对内皮祖细胞进行扩增及分化。本发明的技术方案可提供大量的内皮祖细胞，可解决移植治疗缺血性疾病以及甲型血友病的内皮祖细胞或内皮细胞的来源和数量问题。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。

背景技术

内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于脐带血、成人外周血、骨髓。内皮祖细胞与造血干细胞来自共同的中胚层前体细胞血液血管母细胞(Hemangioblast)，在生理或病理因素刺激下，可以从骨髓动员到外周血中参与损伤血管的修复，而脐血中的内皮祖细胞起源于胎儿的肝脏。近年来的研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，同时，因其可分化为表达FVIII的血管内皮细胞，可作为一种细胞治疗途径用于FVIII缺乏的甲型血友病。

正常情况下，内皮祖细胞的数量极少，外周血中约为500-1000个/mL，脐血中的数量约高3.5倍。早期的内皮祖细胞表达三种祖细胞分子标志：CD133、CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，之后逐渐失去CD133表型和祖细胞特性，并开始表达内皮系的特征性分子标志：血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)，假性血友病因子(vWF)以及凝血VIII因子(FVIII)，从而分化为晚期内皮祖细胞，继续分化为成熟的内皮细胞。

目前，内皮祖细胞的培养技术是从脐血、外周血、骨髓等标本中获得的单个核细胞或CD34、CD133阳性选择后的单个核细胞，在体外包被有人纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的基底上加入血管内皮生长因子(vascular endothelia growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等内皮生长因子进行内皮祖细胞的扩增和分化。现有的内皮祖细胞培养技术可以在体外对人血管内皮祖细胞进行一定程度的扩增，但在保持干性和数量上有局限。

目前，内皮祖细胞的培养技术可以获得一定数量供科研需要，但还无法实现较大规模生产的需求，并且不能充分保持祖细胞的干性。因此，本领域亟待提高扩增的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内皮祖细胞(人血管内皮祖细胞)的高效扩增培养体系。

在本发明的第一方面，提供一种培养人血管内皮祖细胞的方法(为非治疗性方法)，所述方法包括：

(1)利用干细胞扩增培养基扩增CD34⁺单个核细胞(较佳地为CD34⁺、CD133⁺单个核细胞)；

(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得人血管内皮祖细胞；

其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：

干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；

Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；

血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；

白介素3(IL-3)：5-250ng/mL；

粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；和

Sall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL。