[发明专利]山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）属羊痘病毒属（Capripoxvirus）病毒，可引起动物的山羊痘，患病羊主要表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘疹或结节，淋巴结肿大，皮肤水肿，感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失。山羊痘与绵羊痘并称“羊痘”，可以感染人，因而在公共卫生方面还具有重要意义(Key S J．，2007)。山羊痘病毒和绵羊痘病毒的某些分离毒株可同时感染山羊和绵羊(Ahmed A M．，2007)，临床症状和发病机理上相似，传统的病原学检测方法操作复杂，不适宜用于临床的检测，且与其他痘病毒在血清上存在交叉反应，血清型诊断方法也难以区分确定。近年来，越来越多新型检测技术被应用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别。Madhusudan H等人利用PCR-RFLP技术对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行了研究，可以用于这两种病毒的分类及鉴定(Madhusudan H．，2004)。但这种技术在聚合酶链式反应之后还需要对产物进行纯化和酶切，较费时费力。而目前国内外其他一些检测技术也不能区别检测这两种病毒，由此发明一种可鉴别检测山羊痘病毒的方法，对这两种病毒及羊痘病毒属病毒的研究具有重要意义。在羊痘病毒检测方面，尚未有利用TaqMan-MGB荧光定量方法鉴别山羊痘的检测方法。根据上述内容中羊痘可以感染人，对人类食用含有该病毒的肉制品，可能使人患病，因此对食品安全的监督和检测有重大的意义。

由于该病毒的传染性极强，因此对于本病毒的防控就显得尤为重要。荧光定量PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而TaqMan-MGB是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5^，末端，淬灭基团则在3^，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3^，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5^，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

     TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan—MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测山羊痘病毒的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对山羊痘病毒特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。进而本发明的第一个目的是提供一种山羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物用于山羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的检测方法。

为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括山羊痘病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1; 山羊痘病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；山羊痘病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。