[发明专利]一种降低发酵过程中林可霉素B组分的方法

说明书

 

技术领域    

    本发明属于林可霉素生产技术领域，具体涉及一种降低发酵过程中林可霉素B组分的方法。

背景技术    

林可霉素是林可链霉菌（Streptomyces lincolnenisis）产生的一种林可酰胺类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。林可霉素由4-丙基脯氨酸（PPL）和α-甲硫基林可酰胺（MTL）通过缩合反应生成去甲基林可霉，进一步甲基化而生成。

林可霉素及其半合成衍生物克林霉素是临床上广泛应用于抑制革兰氏阳性菌的两种林可酰胺类抗生素。我国林可霉素生产菌株发酵生产上却一直面临着有效组分林可霉素A产量不高和副产物林可霉素B含量偏高的问题。国外研究发现，发酵过程中直接添加作为前提的丙基脯氨酸可以提高林可霉素A的产量而相应减少林可霉素B的产量，但添加甲基化试剂是否会降低林可霉素B的产量则尚未有相关报道。

发明内容    

本发明的目的在于提供一种降低发酵过程中林可霉素B组分的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种降低发酵过程中林可霉素B组分的方法，在发酵过程中加入甲基化试剂。

所述甲基化试剂为甲硫氨酸、叶酸、甜菜碱或氯化胆碱中的至少一种。

甲基化试剂的加入时机为发酵进行80-180h时。

进一步优选，甲基化试剂的加入时机为发酵进行100-120h时。

甲基化试剂的加入量为培养基质量的0.01-0.1%。

进一步优选，甲基化试剂的加入量为培养基质量的0.05-0.1%。

培养基的质量百分配方为：1.5%硫酸铵，0.03%磷酸二氢钾，3%黄豆饼粉，2.0%玉米浆，1.0%碳酸钙，8%葡萄糖，其余为水，pH7.0。

本发明经过多年的实验摸索和筛选，最终确定了在发酵开始后的特定时间加入甲基化试剂，无论是单独的一种甲基化试剂还是多种复合的甲基化试剂，均能够显著地降低林可霉素B组分，从而提高林可霉素A的产量，为林可霉素成本的降低和生产规模的扩大奠定了基础。

具体实施方式  

以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory PRESS,1989）中所述的条件或生产厂商推荐的条件进行。

在本发明的下述实施例中，使用的林可链霉菌（Streptomyces lincolnenisis）已于2008年04月25日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC M 208064。

除特别说明外，以下实施例中使用的%、‰均为重量比。

在本发明实施例中，培养基的质量百分配方为：1.5%硫酸铵，0.03%磷酸二氢钾，3%黄豆饼粉，2.0%玉米浆，1.0%碳酸钙，8%葡萄糖，其余为水，pH7.0。

在本发明的实施例中，采用高效液相色谱法测定林可霉素B组分的含量，中国药典2005版二部－531。

实施例1

将培养好的林可链霉菌种子液按照10%接种量接入含有50mL培养基的500mL三角瓶中，培养温度30℃，摇床转速220r/min，发酵培养进行100h时添加甲硫氨酸（添加量为培养基的0.05%），7天后放瓶效价3900U/mL，林可霉素B组分含量1.4%。

对照例1：以上相同条件下，不添加甲硫氨酸时的对照效价为3760 U/mL，林可霉素B组分含量4.9%。

实施例2

将培养好的林可链霉菌种子液按照10%接种量接入含有50mL培养基的500mL三角瓶中，培养温度30℃，摇床转速220r/min，发酵培养进行120h时添加叶酸（添加量为培养基的0.03%），7天后放瓶效价4000U/mL，林可霉素B组分含量1.3%。

对照例2：以上相同条件下，不添加叶酸时的对照效价为3820 U/mL，林可霉素B组分含量5.0%。

实施例3