[发明专利]一种荧光核酸银及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于金属离子检测和核酸试剂制备领域，特指一种荧光纳米核酸-银簇及其制备方法及其在用荧光光谱法快速检测溶液中二价和三价铁含量的运用。

背景技术

近年来，使用人工合成的探针选择性地感应和识别环境中以及生物体系统中重要的离子特别是重金属离子引起了人们极大的兴趣；铁离子在工业生产上广泛使用，同时它也是人体必需的微量元素之一，铁参与氧的运输与储存，还可以促进发育；增加对疾病的抵抗力；调节组织呼吸，防止疲劳；构成血红素，预防和治疗因缺铁而引起的贫血；使皮肤恢复良好的血色；铁(铁食品)虽然是人体必需的微量元素(微量元素食品)，铁本身也不具有毒性，但当摄入过量或误服过量的铁制剂时也可能导致铁中毒、心脏和肝脏疾病、糖尿病等，所以，在环境中以及生物体系统中简便并快速检测铁离子就显得尤为重要；近年来分光光度法被报道用于溶液中铁离子的检测[王爱荣, 谷永庆, 王少冷. 微量铁的分光光度测定概述[J]. 廣東微量元素科學, 2005, 12(9): 5-10]，但这些方法难以精确测量细胞中的金属离子且不能很好地区分二价铁离子和三价铁离子；荧光探针在生物和环境检测中有着广泛的应用,荧光探针的高灵敏性、高选择性使它成为化学分析中不可缺少的手段；以DNA为模板的银纳米簇因其良好的生物兼容性和较低的毒性而逐渐兴起[Zhao T T, Chen Q Y, Zeng C, Lan Y Q, Cai J G. Multi-DNA–Ag nanoclusters: reassembly mec hanism and sensing the change of HIF in cells [J]. J. Mater. Chem. B, 2013, 1(36): 4678-4683.; Obliosca J M, Liu C, Yeh H C. Fluorescent silver nanoclusters as DNA probes [J]. Nanoscale, 2013, 5(18): 8443-8461.]；荧光核酸银纳米团簇与特殊目标物质相互作用会引起荧光强度的改变，这为铁离子的定性和定量检测提供了一个新的思路，核酸银用于三价和二价铁离子的区别国际上未见报道，我们的研究将为生物体内铁离子种类的快速鉴别提供新的方法。

发明内容

我们以一种序列为5’-CCC TCC CTT CCC TCC CCG GGC CAA GAG TGT GCT AAA-3’的小分子核酸（DNA) 为模版，上述核酸购自上海生工生物工程有限公司，合成了一种新型荧光DNA纳米银簇（标记为DNA-AgNCs)；纳米银簇的大小为2~4 nm；它的水溶液显示淡黄色，用600 nm红光激发，660 nm处有较强的荧光发射， 荧光量子产率为0.2 （以联吡啶钌为对照），其660 nm处的荧光能被三价和二价铁离子淬灭（参见附图2），说明该核酸纳米银簇（DNA-

AgNCs）是一种灵敏的荧光探针，由图2可见该DNA-AgNCs的荧光对于二价铁和三价铁离子有明显不同的荧光感应，对二价铁的灵敏度远远高于三价铁， 因此，可用于定性和定量分析三价和二价铁的总量以及低浓度二价铁（10^-9 ~10^-5μM）和三价铁（10^-6~10^-1μM）的定性分析。

新型荧光DNA纳米银簇（DNA-AgNCs)的合成反应过程如下：将DNA和AgNO₃溶液混合于柠檬酸钠缓冲液（pH 5，10 mM）中，DNA与Ag⁺的浓度分别为6.4 μM和100~200 μM （最佳为200 μM）；将混合溶液转到水浴加热，温度升到70~80 ℃（最佳为DNA的Tm值75 ℃）后稳定三分钟，缓慢降温到室温，降温过程为3.5-6小时，最佳为3.5小时；最后在上述溶液中以摩尔比BH₄^-:Ag⁺ = 1:1~2:1（最佳为2:1）加入NaBH₄（10 mM）溶液，混匀于室温避光保存10分钟后转到4 ℃避光保存24-40小时，最佳36小时；用600 nm 红光激发， 测660 nm 处发射，即可得到稳定的荧光探针。

反应液的最终体积为1 ml。

本发明的优点：