[发明专利]一种试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学和医学检验领域，具体涉及一种用于提示宫颈癌病变的尿液中巯基类代谢物检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

目前常见的宫颈癌筛查方法有HPV(人乳头瘤病毒)检测，TCT(液基薄层细胞检测)、巴氏涂片检测和病理学诊断。现有检测方法试剂成本高，检测过程较复杂，周期长，不能适应目前大范围宫颈癌普查的需要。

随着生物学技术的发展，研究人员发现女性尿液中巯基类代谢物水平的显著升高，可以提示宫颈癌病变的发生。而通过巯基类代谢物的检测可以较好地提前预知宫颈癌病变的发生。这是因为HPV(人乳头瘤病毒)被认为是导致宫颈癌的最主要病因，HPV16编码的E6原癌基因蛋白通过E6AP连接介导与细胞蛋白P53结合，再通过体内泛素途径促进P53降解，造成宫颈细胞中P53蛋白或阻抑蛋白的巯基分子大量且不可逆脱落并从尿液中排出。正常妇女没有巯基代谢物从尿液中排出，通过女性尿液中巯基类代谢物水平检测可以提示宫颈癌病变的发生。

发明内容

本发明根据现有技术的不足公开了一种试剂盒及其制备方法。本发明要解决的问题是提供一种用于提示宫颈癌病变的尿液中巯基类代谢物检测试剂盒，本发明还提供上述试剂盒的制备方法和应用检测方法。

本发明首先提供的检测试剂盒：

试剂盒由以下试剂组成：一组对照剂、一组测试剂，两组显色剂；

所述对照剂是氯化汞溶液或硫酸汞溶液，浓度为0.02mol-0.05mol/l；所述测试剂是蒸馏水；

所述显色剂是磷钨酸试剂和缓冲溶液按体积比1:1的混合物；其中磷钨酸试剂由下列组分含量的水溶液组成：钨酸钠40g-60g/l，85％磷酸30ml-50ml/l，硫酸锂30g-50g/l；所述缓冲溶液是乙酸钠/乙酸缓冲溶液或磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液，缓冲溶液PH为PH5.4-PH5.8。

上述每盒试剂盒包括一组1ml对照剂、一组1ml测试剂和两组各2ml显色剂，各组试剂均封装在5ml安瓿中。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括：

(1)蒸馏水制备并无菌封装测试剂；

(2)对照剂制备：按浓度0.02mol-0.05mol/l要求称取氯化汞或硫酸汞，溶于蒸馏水后无菌封装；

(3)显色剂制备：

a、磷钨酸试剂制备，称取钨酸钠40g-60g，溶于蒸馏水300ml-500ml中，加85％磷酸30ml-50ml，回流煮沸2小时，冷却至室温，加蒸馏水定容至1000ml，最后加入硫酸锂30g-50g，置于2℃-8℃冷藏保存备用；

b、缓冲溶液制备：缓冲溶液为PH5.4-PH5.8，按PH值要求配制乙酸钠/乙酸缓冲溶液，或磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液，置于2℃—8℃冷藏保存备用；

c、将步骤a和步骤b制备的磷钨酸试剂溶液与缓冲溶液按体积比1:1混合均匀，置于2℃—8℃冷藏保存并无菌封装备用。

本发明还提供了上述试剂盒的应用检测方法：

分别取晨尿试样0.5ml滴入一盒试剂盒的对照剂和测试剂中，摇匀，静置片刻，分别加入一组显色剂；观察对照剂溶液和测试剂溶液的颜色变化，若两溶液颜色一致则判定为阴性；若两溶液颜色不同，且测试剂颜色显示的蓝色比对照剂颜色更深则判定为阳性。

本发明利用在一定PH的酸性环境中，巯基使磷钨酸还原成钨蓝而呈蓝色的特性实现。研究发现：磷钨酸能被巯基等具有还原性的物质还原，在适当的PH条件下尿液中存在的尿酸、Vc等也能使磷钨酸还原，造成对检测巯基代谢物的干扰。本发明试剂盒设对照剂(含氯化汞或硫酸汞)和测试剂(蒸馏水)排除干扰，因为氯化汞或硫酸汞在磷钨酸加入前会与巯基结合，其他还原物质如尿酸、Vc仍将磷钨酸还原成蓝色，如样品中含有巯基类代谢物，则没有与氯化汞或硫酸汞结合的巯基类代谢物会还原磷钨酸使蓝色显示更深。显色剂中的硫酸锂在氧化还原反应中作为H+的中间受体。

本发明有益性：本发明提供了一种用于提示宫颈癌病变的尿液中巯基类代谢物检测试剂盒及其制备方法，研究证明女性尿液中巯基类代谢物水平的显著升高，可以提示宫颈癌病变的发生，尿液中巯基类代谢物检测试剂盒可以检测到临床前阶段和临床阶段的宫颈癌患者尿液巯基类代谢物的含量，临床研究证明本发明试剂盒对宫颈癌检测阳性率和准确度高，无漏诊，受检者无创伤、无交叉感染，不需要仪器设备；检测过程简便、受检者接受度高，可大幅节省人力、物力投入，显著减少普查人员的工作量，有效突破筛查数不达标的瓶颈，非常适合大范围宫颈癌普查；本发明制备方法简便，制备成本低，适合大规模普查和筛查的需要。