[发明专利]磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法。

背景技术

在分子生物学技术中，无论是建立基因文库、酶切、分子克隆还是全基因组关联分析，都需要从样本中提取DNA模板。所提取的DNA浓度、纯度以及一级结构的完整性直接影响到后续研究，因此DNA的质量好坏是基因研究成败的首要因素。

在传统DNA提取方法中，离心柱法和酚-氯仿法是最主要的两种方法，其提取的DNA虽质量较高，但检测时间长、劳动强度大，最重要的是实验过程中所使用的氯仿等有毒试剂对操作者和生态环境都造成很大的伤害，而采用磁珠为载体的分离技术，无需离心，无需接触有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化，短时间就能实现样本DNA的快速、高质量的提取，是未来高通量提取核酸发展的一个重要方向，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势。

目前，国外比较知名的生物技术公司，如Qiagen、Promega、Amresco等都相继开发出了磁珠法核酸提取试剂盒或磁珠法高通量核酸提取仪，他们的产品大都操作步骤简单、获得的核酸质量高，片段完整，但价格昂贵；国内比较知名的生物技术公司，如天根、康为世纪、金麦格等开发出的磁珠法核酸提取试剂盒，内置磁珠均为多分散磁珠，虽然磁响应速度很快，但磁珠沉降速度也很快，由此导致磁珠与缓冲液作用不充分，这也成为制约其产品发展的一个主要因素。因此，在国内开发内置磁珠为单分散磁珠并配合相应的缓冲液系统，使获得的DNA片段大、纯度高、质量稳定可靠，满足后续实验要求的磁珠法核酸提取产品已迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种采用磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，包括缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、磁珠悬浮液D、缓冲液E、缓冲液F、缓冲液G七种组分；

所述缓冲液A终浓度组成为：20-50mmol/L葡萄糖、10-30mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、5-20mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），溶剂为高压灭菌水 (缓冲液A终PH=8.0-8.5)；

所述缓冲液B终浓度组成为：15-25mg/ml蛋白酶K、1-5mol/L盐酸胍、5-25mmol/L柠檬酸钠、1-2%曲拉通（Triton X-100）、0.5-5mmol/L EDTA，溶剂为高压灭菌水 (缓冲液B终PH=4.0-5.5)；

所述缓冲液C成分组成为：无水乙醇溶液；

所述缓冲液E终浓度组成为：1-5mol/L醋酸钠，体积分数为20-40%无水乙醇，溶剂为高压灭菌水 (缓冲液E终PH=4.0-5.5)；

所述缓冲液F终浓度组成为：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L 0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L柠檬酸钠和无水乙醇，0.3-0.7 L/L的无水乙醇，溶剂为高压灭菌水 (缓冲液F终PH=8.0-8.5)；

所述缓冲液G终浓度组成为：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA，溶剂为高压灭菌水 (缓冲液G终PH=8.0-8.5)。

所述磁珠悬浮液D成分组成为：每200mmol/L氯化钠水溶液中含有50mg单分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS纳米磁珠。单分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS纳米磁珠通过以下步骤制备得到：

（1）溶剂热法制备单分散的四氧化三铁纳米球；

（2）采用改进的Stöber法，在四氧化三铁纳米球外包覆二氧化硅，得到单分散的Fe₃O₄@SiO₂纳米球，具体为：称取0.1g步骤（1）制备得到的四氧化三铁纳米球，向其中依次加入20ml去离子水、80ml无水乙醇和1ml质量分数为28%的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯，室温（20°C）下机械搅拌6小时；反应完毕后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄@SiO₂纳米球），将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；