[发明专利]H5亚型禽流感疫苗候选株rS‑156‑/170+/181‑及其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过反向遗传技术对H5亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白糖基化位点进行修饰构建广谱性H5亚型AIV疫苗的方法，主要涉及的AIV分布于2.3.4分枝、2.3.2.1分枝和7.2分枝中。

背景技术

H5N1亚型高致病性禽流感可导致家禽的高发病率和高病死率，在中国、越南、印度尼西亚、印度、孟加拉国和埃及呈地方流行性(联合国粮农组织，http://www.fao.org)，给养禽业带来了巨大的经济损失。自1997年首次报道AIV能直接感染人以来，先后有H5N1、H9N2、H7N7和H7N9亚型AIV感染人类的报道。截止2013年10月8日为止，世界卫生组织(WHO)(http://www.who.int)报道全世界已有641例人感染H5N1亚型AIV，其中380例死亡，死亡率接近60％。因此，高致病性H5亚型AIV既危害养禽业的发展，又危害人类健康，是非常重要的人兽共患病。

接种疫苗是防控流感病毒(Influenza virus,IV)最有效的手段，但IV是分节段的RNA病毒，由于RNA聚合酶的复制保真性较低，故病毒基因组变异较快，需要使用匹配流行株的疫苗进行疫病防控。当前，在我国普遍使用的多为反向遗传技术构建的全病毒灭活疫苗，如Re-4、Re-5和Re-6。利用反向遗传技术可快速替换当前流行株表面糖蛋白构建出疫苗候选株，进行疫苗株的升级换代以应付禽流感疫情。由于反向遗传技术构建的疫苗大多以PR8为骨架，因此在大流行时期可以用MDCK细胞大量生产疫苗株病毒，以缓解鸡胚供应的压力。目前我国家禽中流行的H5N1亚型AIV主要分布于2.3分枝中的2.3.4和2.3.2分枝及7分枝中的7.2分枝，不同分枝病毒间交叉保护性较差。而且这些优势流行病毒又进一步进化出第四级分枝，抗原性和免疫原性发生进一步变化，现有疫苗不能提供完全保护。显然，依靠匹配流行株的疫苗研制速度永远跟不上病毒变异的速度。因此，广谱性疫苗因其可以提供交叉保护性而受到广泛关注。2008年，Chen等基于一段HA保守序列制备了一种DNA疫苗，攻毒保护试验表明，该疫苗可对1分枝、2.2分枝及2.1分枝感染小鼠提供较好的保护。2012年，Janulikova等基于HA2蛋白的胞外区和融合肽段制备了偶联多肽苗，此疫苗可在小鼠上抵挡H3或H7亚型流感病毒的攻击。由此可见，多数研究者都致力于挖掘通用的抗原表位，并将其制备成疫苗。通过文献调查可以发现，糖基化修饰会影响AIV的抗原性和免疫原性。Wang等(2009)以去糖基化修饰的HA蛋白作为免疫原，其攻毒保护性能明显优于野生型HA蛋白，且其血清显示较强的交叉中和能力。

发明内容

高致病性H5亚型AIV给养禽业带来了巨大的危害，病毒变异较频繁且基因型较多，不同基因型间交叉保护性较差。因此，急需研制交叉保护性较好的新型广谱性疫苗来应对H5亚型禽流感疫情。

本发明以2.3.4分枝的A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株为母本，母本病毒的糖基化位点为S-156-/170+/181+，主要通过增加HA蛋白156位糖基化修饰，缺失其HA蛋白170和181位糖基化修饰，形成不同组合模式，利用反向遗传技术拯救出6株H5亚型AIV疫苗候选株。病毒灭活后制成油佐剂疫苗免疫SPF鸡制备血清，评价其对不同分枝H5亚型AIV交叉中和性，筛选出交叉中和能力好的疫苗候选株。制备灭活疫苗免疫动物，通过攻毒保护试验测定其免疫保护作用。

本发明所述的一株H5亚型禽流感疫苗候选株，是rS-156-/170+/181-，它的结构是以A/mallard/Huadong/S/2005株为母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修饰。

所述H5亚型禽流感疫苗候选株rS-156-/170+/181-的构建方法，是以A/mallard/Huadong/S/2005株为母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修饰而获得。

本发明还公开了所述H5亚型禽流感疫苗候选株rS-156-/170+/181-在制备广谱性H5亚型AIV疫苗中的应用。