[发明专利]一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于离子束技术领域，具体涉及一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法。

背景技术

D-阿拉伯糖醇是一种五碳糖醇，分子式为C₅H₁₂O₅，分子量为152.12，是木糖醇和核糖醇的同分异构体。糖醇是经糖还原的一类多元醇，具有低热值、抗龋齿、不影响胰岛素水平等优点，在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值。目前，常规生产D-阿拉伯糖醇的方法主要是化学法合成，但是该方法反应过程复杂、设备要求高、环境污染严重。针对化学合成法的缺点，人们将目光集中于通过生物转化法生产D-阿拉伯糖醇，其反应条件温和、生产工艺简单，因而备受关注。

Spencer等人研究发现耐高渗酵母在高渗条件下可产生多元醇，代谢葡萄糖产生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇为主，截止目前可用于生产D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、拟内袍霉属(EndomycoPsis)、小丛梗袍属(Moniliella)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)。但是，大部分产D-阿拉伯糖醇的酵母菌株对底物葡萄糖的转化率较低，多数酵母菌株的转化葡萄糖产D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的转化率介于10％～40％之间，并且普遍存在甘油及其他多元醇副产物。乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母，具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25～46℃)、分泌蛋白能力强、不产生内毒素、对人类安全等优点，因此长期以来一直被用于发酵工业。

低能离子N⁺注入技术作为一种新的诱变源,目前在国内微生物育种中取得显著成效,其原因在于低能离子注入生物体时同时存在能量交换、能量沉积、质量沉积及电荷交换四大效应。由于注入离子的电荷数、质量数、能量和剂量的组合不同，可以提供众多的诱变条件，使离子注入诱变具有突变谱宽，突变率高的特点，从而可以筛选到符合生产要求、提高产量的突变体。然而低能N⁺离子注入技术转化的随机性较大，建立一种高通量的快速筛选方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)初筛：将经过诱变的出发酵母菌株接种于YPD液体培养基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振荡培养24～28h得预培养液，将预培养液涂布于高糖固体培养基上，然后于28～37℃恒温培养48～60h，所述高糖固体培养基含有500～550g/L的葡萄糖；

2)复筛：经过恒温培养后，挑取生长于高糖固体培养基上的单菌落并接种于YPD液体培养基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振荡培养24～28h得种子培养液，将种子培养液接种于YPD发酵培养基中，然后于160～200r/min、28～37℃下振荡培养96～144h得发酵液，将发酵液离心，将离心得到的上清液用纸色谱法进行分析，根据纸色谱上D-阿拉伯糖醇对应的显色斑点筛选D-阿拉伯糖醇产量较高的突变菌株。

利用低能离子注入技术对出发酵母菌株进行诱变。

所述出发酵母菌株为乳酸克鲁维酵母。

所述诱变具体包括以下步骤：

a)挑取出发酵母菌株单菌落接种于YPD液体培养基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振荡培养18～24h得菌液；

b)用无菌水将菌液稀释至0.5～1.0×10⁷CFU/mL得菌体稀释液，将100～150μL菌体稀释液均匀涂布于无菌平皿中央，然后用无菌风吹干得菌膜；

c)将菌膜置于离子注入机的无菌靶台上，并按以下条件对菌膜进行低能离子注入：注入离子为N⁺，注入剂量为1.5×10¹⁵～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10^-4Pa。

所述高糖固体培养基的组成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的琼脂。