[发明专利]完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法

权利要求书

1.一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于包括如下步骤：首先通过翻译延伸抑制剂抑制细胞的翻译活动，然后去除培养液，清洗细胞，再将清洗后的细胞用液氮进行快速冷冻处理，接着将快速冷冻处理好的细胞置于不高于-80℃的环境下保存；使用时将细胞转移至冰上解冻即可。

2.根据权利要求1所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

(1)抑制细胞的翻译活动：在正常生长的细胞培养液中加入翻译延伸抑制剂，摇匀，翻译延伸抑制剂的用量为能稳定抑制细胞翻译延伸；接着将细胞置于原培养环境中培养，该培养的目的是为了使得翻译延伸抑制剂能有效作用于RNC，抑制翻译延伸的进行；然后将细胞立即冷却至0～4℃，以使其其余代谢过程基本停止，防止RNC被降解；

(2)去除培养液，对不同细胞的操作具体如下：

①对悬浮培养细胞进行离心，弃上清，取沉淀；

②对贴壁生长细胞而言，倒出培养液即可；

(3)清洗：使用预冷至0～4℃的PBS溶液清洗细胞，清洗完毕后弃去PBS溶液；对不同细胞的操作具体如下：

①将PBS溶液加入悬浮培养细胞中，将悬浮培养细胞悬于PBS溶液后离心，弃上清，取沉淀；

②将PBS溶液加入贴壁生长细胞中，再倒出PBS溶液即可；

(4)快速冷冻处理：加入预冷至0～4℃的PBS溶液，待速冻完毕温度稳定在液氮温度后进行下一步；对不同细胞的操作具体如下：

①对悬浮培养细胞的操作为将细胞悬于PBS溶液后立即浸没于液氮中；

②对贴壁生长细胞的操作为将PBS溶液浸没过细胞后立即放入液氮中；

(5)超低温保存：将速冻完毕的细胞转移至超低温保存环境，该超低温保存环境应满足温度始终不高于-80℃；在该条件下，能进行储存和运输；

(6)解冻：储存和运输后需解冻以继续提取RNC时，将细胞从超低温保存环境迅速转移至冰上，等待解冻过程中避免震动，直至完全解冻。

3.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的PBS溶液为pH7.2～7.4、0.01～0.1mol/L的PBS溶液。

4.根据权利要求3所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

所述的PBS溶液通过如下步骤制备得到：称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，再用水定容至1000ml，除菌；

当所述的水为DEPC处理水时，所述的除菌为过滤除菌或高压灭菌；高压灭菌的条件为115～121℃灭菌15～60min；

当所述的水不是DEPC处理水时，只能高压灭菌，条件为121℃高压蒸汽灭菌60min。

5.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的翻译延伸抑制剂在所述的细胞培养液中的终浓度为能完全抑制翻译延伸的最低浓度的2倍以上。

6.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的将细胞置于原培养环境中培养的时间为10～20分钟。

7.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的翻译延伸抑制剂为放线菌酮或氯霉素。

8.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的冷却的温度为0℃。

9.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述的离心的条件为800～1000rpm离心10～20min。

10.根据权利要求2所述完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的超低温为-196～-80℃。