[发明专利]一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

背景技术

新城疫病(Newcastle Disease，ND)，又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一种禽类高度接触性和急性败血性的传染病，是严重危害世界养禽业的重大烈性传染病之一。NDV是一种RNA病毒，几乎可以感染所有禽类，病鸡是该病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24h，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4～5d内波及全群。

目前，预防新城疫的主要方法是接种疫苗免疫。由于弱毒疫苗使用方便且能够诱导体液免疫和局部黏膜免疫，在国内外被普遍应用。但此类疫苗常常需要在首次接种后的15天左右才能产生相应保护抗体，即存在免疫空白期。如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。因此，在新城疫的预防工作中，迫切需要一种可以刺激机体快速产生抗体从而缩短免疫空白期的高效安全的新型弱毒疫苗。此外，母源抗体的干扰是新城疫疫苗早期免疫失败的重要原因之一，抵抗母源抗体干扰的新城疫疫苗，在新城疫免疫实践中具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

本发明提供的鸡新城疫病毒毒株(命名为rClone30-GM-CSF病毒)，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF为具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30-GM-CSF病毒的基因组DNA。

所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF具体可为序列表的序列3所示的质粒。

所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。

rClone30-GM-CSF病毒的制备方法具体如下：

(1)将所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×10⁶个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-GM-CSF、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO₂、37℃环境中静置培养72h；

(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有rClone30-GM-CSF病毒)。

rClone30-GM-CSF病毒的制备方法具体如下：

(1)将所述重组质粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×10⁶个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-GM-CSF、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO₂、37℃环境中静置培养72h；

(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

(5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30-GM-CSF病毒液。