[发明专利]一种用于胸腺肽制剂活力检测中动物胸腺脱E受体胸腺T细胞的提取方法

说明书

本发明涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱E受体胸腺T细胞(即淋巴细胞)的提取方法。该提取方法包括步骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得。本发明提供的提取方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

技术领域

本发明涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。

背景技术

胸腺肽(Thymosin)，又名胸腺素，是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，其生理功能包括：连续诱导T细胞分化、发育的各个阶段；维持机体免疫平衡状态，增强T细胞对抗原的反应；提高机体抵抗疾病的能力。胸腺肽的可以作为一种免疫调节药，主要用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病、某些自身免疫性疾病，还可以对各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤进行辅助治疗，其适应症主要包括：各型重症肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎及肝硬化等；带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣等；支气管炎、支气管哮喘、肺结核、预防上呼吸道感染等；各种恶性肿瘤前期及化疗，放疗合用并用；红斑狼疮、风湿性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综合症等；再生障碍性贫血、白血病、血小板减少症等；病毒性角膜炎、病毒性结膜炎、过敏性鼻炎等；老年性早衰、妇女更年期综合症等；多发性疖肿及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症等；儿童先天性免疫缺陷症等。由于疗效确切、副作用小，胸腺肽已成为治疗各种免疫性疾病的主要药物。

在胸腺肽制剂的制备中，检测产品中胸腺肽的活性对于质量控制是至关重要的。胸腺肽活性常采用T细胞活性测定法—脱E受体法进行测定，它的检测原理是根据胸腺肽可使脱E受体后的胸腺T细胞(即淋巴细胞)恢复其E受体功能，从而反映胸腺肽的生物活性，其主要操作过程包括：(1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备；(2)绵羊红血球悬液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定：求得供试品管E玫瑰花结百分率和对照管E玫瑰花结百分率，根据如下计算公式求得样品活力：

样品活力＝供试品管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率

目前，在步骤(1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备主要采用国家药品标准WS1-XG-042-2000操作方法进行，操作方法为：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液。用Hank’s液洗涤稀释并计数。采用此方法提取的脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度只有约0.2×10⁶个/mL，由于其脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度低，无法满足活力测定的需求。因此，提供一种高浓度的脱E受体胸腺T细胞悬液的制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。该提取方法通过调整离心的参数后，可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法，包括如下步骤：

取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；

取第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；