[发明专利]一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

癌症干细胞具有与组织干细胞类似的分子标记、自我更新和分化功能，在移植后能重现原癌症的组织学、分子生物学等特征，耐常规放疗和化疗，是癌症发生、复发和转移的主要原因，因此癌症干细胞正成为癌症研究的重要领域和癌症治疗的主要靶标。但目前的抗肿瘤药物主要用癌症细胞系筛选获得，缺乏针对肿瘤干细胞的药物，也缺乏良好的基于肿瘤干细胞的药物筛选模型。

胶质母细胞瘤是最常见的脑肿瘤，恶性程度极高。随着癌症研究的进展，大部分癌症的治愈率和生存期都获得了明显改善，但胶质母细胞瘤病人的生存期在过去几十年中没有显著改观，平均仅约1年，迫切需要研发新的治疗药物。胶质母细胞瘤干细胞是最早确定的实体瘤干细胞之一，也是为数不多的在体外能稳定长期培养的肿瘤干细胞之一，为利用胶质母细胞瘤干细胞进行药物筛选奠定了基础。

药物筛选模型是寻找和发现新药物的重要条件之一。目前抗肿瘤药物的筛选方法主要在包括体内和体外筛选方法，体内筛选方法成本高，操作难度大，不利于高通量的药物筛选；体外筛选方法主要是在分子和细胞水平上实现的，具有材料用量少，作用机制明确，易用于大规模筛选等优点，是药物筛选的主要方法。

药物筛选细胞模型常用报告基因随机插入建立稳定细胞株，控制外源标记基因表达的启动子活性常受到整合位点附件基因组DNA的影响，因此标记基因的变化并不能完全反映内源基因的变化，影响药效的评价。

综上所述，有必要建立良好的基于胶质母细胞瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选模型。

发明内容：

本发明针对现有抗肿瘤药物筛选技术存在的不足，提供一种简便、快速、直接、经济的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其建立方法和应用。

本发明的抗肿瘤药物的细胞模型，是从胶质母细胞瘤中分离的，定点整合了报告基因的肿瘤干细胞，含有A－B－C－D结构的DNA构建物，其中：

A，D为胶质母细胞瘤干细胞分子标记基因启动子及下游序列，B为报告基因序列，C为嘌呤霉素抗性基因puro序列；

胶质母细胞瘤干胞分子标记基因是但不限于Nestin基因；报告基因为但不限于绿色荧光蛋白基因EGFP，或YFP、RFP荧光蛋白，或荧光素酶luciferase。

本发明的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法，运用同源重组技术，将报告基因绿色荧光蛋白EGFP定点整合至肿瘤干细胞分子标记基因Nestin启动子下游，建立药物的细胞毒性和分化诱导筛选平台。

本发明的抗肿瘤药物的细胞模型用于筛选抗肿瘤干细胞的细胞毒性和诱导分化的物质(如小分子化合物、多肽)。即：

将候选物质加入上述的培养细胞中，用高内涵设备或荧光显微镜检测药物组中报告基因的表达，并与对照组比较，所述对照组是不添加候选物质的上述细胞。如果测试组中报告基因表达细胞数低于对照组，就表明候选物质能够抑制肿瘤干细胞增殖或诱导细胞凋亡；如果单个细胞中报告基因表达水平降低则说明候选物质能够诱导肿瘤干细胞分化。

本发明的抗肿瘤药物的细胞模型还能对筛选出的抗肿瘤干细胞物质进行进一步的细胞/动物实验，以确定这些物质在抗肿瘤药物研发中的前景。

本发明的有益效果在于：

1、避免了多拷贝转基因所致的基因组不稳定性、转基因插入会破坏内源基因、转基因所用启动子受插入位点两侧序列影响不能完全反映启动子活性变化的不利影响，检测结果将能正确反映药物作用效果。

2、具有简便、快速、直接、经济的优点。

附图说明：

图1是将EGFP定点整合至nestin启动子下游的打靶示意图。

图2-a和图2-b显示腺病毒感染肿瘤干细胞后荧光观察结果。

图3-a和图3-b显示腺病毒感染肿瘤干细胞后PCR检测阳性克隆细胞。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南(sambrook,J.)中所述的方法，或按照实验所用试剂或仪器说明书建议方法。

一、构建物及载体

所述构建物从5’端到3’端依次含有nestin启动子序列，报告基因序列，内部核糖体进入位点序列(IRES)或者自剪切2A肽序列,嘌呤霉素抗性基因序列(puro)，转录终止信号序列(polyA)和nestin启动子下游序列。