[发明专利]乙醇高温高产工程菌株的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。尤其涉及通过工程菌株改造来提高高温下利用木糖发酵生产乙醇的技术领域。具体地，本发明构建了能够在高温条件下利用木糖发酵生产乙醇且乙醇生产速率和产量大幅度提高的耐热工程酵母菌株。 

背景技术

木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料(Zhang et al.,2011)。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键(Sasaki et al.,2010)。 

乙醇是醇类的一种，是酒的主要成份，所以也俗称酒精。乙醇的用途很广，可以用作溶剂，作为有机合成的原料，用于各种化合物的结晶，还可以作为洗涤剂和萃取剂，食用酒精可以勾兑白酒。乙醇在化工行业也有很重要的用途。生物乙醇最重要的用途是在能源领域。乙醇可以调入汽油，作为车用燃料，乙醇汽油也被称为(E型汽油)，它可以改善油品的性能和质量，降低一氧化碳、碳氢化合物等主要污染物排放。 

采用耐热酵母马克思克鲁维酵母(K.marxianus)在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonseca et al.,2008；Zhang et al.,2013)；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险(Kumar et al.,2009；Zhang et al.,2013)。除此之外，马克思克鲁维酵母是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86–0.99h^-1, 40℃)(Banat and Marchant,1995)。马克思克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于马克思克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，马克思克鲁维酵母被越来越多的用于生物能源的生产(Fonseca et al.,2008)。所以利用马克思克鲁维酵母发展成乙醇生产菌株具有非常重要的应用价值。 

已经有一些关于利用耐热酵母发酵木糖生产乙醇的研究，其中，Rodrussamee等利用马克思克鲁维酵母可以在40℃利用木糖生产2.2g/的乙醇(Rodrussamee et al.,2011)。Zhang等利用树干毕赤酵母的木糖还原酶突变体替换马克思克鲁维酵母的木糖还原酶，可以利用40g/L的木糖在42℃生产4.51g/L的乙醇(Zhang et al.,2013)。Wang等构建木糖异构酶途径代替马克思克鲁维酵母本身的XYL1-XYL2系统，可以利用50g/L的木糖在42℃生产11.52g/L的乙醇(Wang et al.,2013)。Kumar等利用Kluyveromyces sp.IIPE453发酵木糖在50℃产生1.75g/L乙醇(Kumar et al.,2009)。Goshima等利用基因工程改造的马克思克鲁维酵母DMB3-7可以在42℃发酵木糖产生4.9g/L乙醇，在45℃产生3.3g/L乙醇(Goshima et al.,2013)。而Dmytruk等利用木糖异构酶途径改造的另一种酵母Hansenula polymorpha可以在48℃发酵木糖产生1.31g/L乙醇(Dmytruk et al.,2008)。Ismail等构建了一株比较耐热的利用基因工程菌Saccharomyces cerevisiae sun049T可以在38℃发酵木糖产生15.2g/L乙醇(Ismail et al.,2013)。以上的这些研究还没有充分发挥耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇的潜力，他们利用木糖发酵的速率、产量以及利用木糖的能力都还远远不够(表1)。我们的此发明申请中的NcXYL1-PsXYL2的ARS突变基因组合结合增加的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的表达大幅度提高了耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇，结合产生木酮糖之后的下游代谢工程改造进一步提高了木糖发酵的能力，产量和发酵速率都远超已有的菌株，证明本发明构建的方法和构建的菌株在生物质转化乙醇工业上有很巨大的应用前景。 

发明内容