[发明专利]一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选保护或改善肾功能活性化合物的方法，属于医药生物技术领域。

研究背景

随着社会发展，生活节奏加快，加上人们不良的饮食习惯和生活方式，导致糖尿病、高血压、心脏病等慢性疾病发病率明显增加，这些疾病通常需要常年服药，容易对肾脏功能造成损伤，同时，经济快速发展带来的日益严重的环境污染，进一步加剧了肾脏损伤的发生。临床上，肾脏病变具有起病隐匿、治疗难、死亡率高的特点，临床可用的治疗方法和治疗药物非常有限，发展至后期患者只能依靠透析甚至换肾以维持生命，给患者及其家庭带来巨大的痛苦和沉重的经济负担。因此，确立快速、有效的筛选方法，加快创新药物的研发，对肾脏疾病的预防和治疗具有重大意义。

利用整体动物模型开展的体内实验，将受试样品置于复杂的机体内环境下，能客观反映样品在体内的代谢规律和作用机制，及体内各器官相互作用下机体的反应，所获得的结果可靠性高，参考价值大。但这些模型动物饲养成本高、繁殖周期长，很难实现化合物活性的快速、高通量筛选。斑马鱼作为一种理想的脊椎模式生物，已在发育生物学、疾病模型及药物研发等领域得到广泛应用。与其他哺乳动物模型比，斑马鱼产卵量高，发育周期短，药物用量少，可重复性强，更适用于大规模化合物筛选研究。

肾脏在进化中具有三种形式：前肾、中肾和后肾，在斑马鱼物种，肾脏分为幼鱼期的前肾和成鱼期的中肾。在胚胎受精后14h(14hpf，14hours post-fertilization)斑马鱼肾脏开始发育，72hpf时肾脏发育完成。斑马鱼前肾由一对肾单位组成，前肾的解剖结构比成鱼的中肾及哺乳动物的后肾简单，但在细胞组成及分子水平上与哺乳动物的肾脏相似，并已具备同样复杂的生物功能。而且，许多化合物引起的斑马鱼胚胎肾脏反应与人类的肾脏反应非常相似。另外，斑马鱼发育第一周内，由于鳃还未发育完全，主要依赖肾脏排出体内多余的水分和代谢废物，加之此阶段仔鱼不必喂食即可存活，干扰因素少，非常有利于开展肾脏相关方面的研究。

疾病导致机体病理生理发生变化，必然引起组织中代谢组分含量的变化，对这些组分，尤其是一些与器官功能状态密切相关的生物标志物的检测，是诊断疾病发生、发展的重要依据。肌酐是肌肉的代谢产物，由前体化合物磷酸肌酸转化而成，主要由肾脏排出体外。肾功能受损时，肌酐在体内蓄积成为有害毒素。临床上，血肌酐值是了解肾脏功能的重要指标，在以啮齿类动物模型开展的肾脏相关实验中，血、尿肌酐值是必不可少的检测项目。对斑马鱼胚胎，由于体积小，难以获取足够的血液或尿液样本，目前，针对斑马鱼胚胎肌酐方面的检测资料尚无报道，但已有研究表明，自胚胎受精之后的一段发育时期内，胚胎组织中的肌酐含量呈逐步上升趋势，这与胚胎活动能力逐渐增强有关，也说明组织中的肌酐水平与机体的功能状态息息相关。而作为肾脏功能标志物，了解斑马鱼组织中肌酐含量的变化对掌握肾脏功能状态具有重要指示意义。

发明内容

本发明针对现有方法的不足，提供一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法。

发明概述

本发明将能造成肾脏损伤的化合物与待测化合物共同作用于斑马鱼胚胎，或者先用肾毒性化合物作用于斑马鱼胚胎造成肾脏损伤然后再用待测化合物处理损伤后的胚胎，利用胚胎组织中的的肌酐含量变化作为检测肾脏功能的指标，分析待测化合物是否具有保护或改善肾功能活性，建立一种具有快速、可靠、高通量特点的活性化合物的筛选方法，为肾脏疾病治疗药物的研究开发提供先导化合物。

发明详述

本发明的技术方案如下：

一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含已知肾毒性化合物的培养水溶液中，培养20～28h，然后去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，制得损伤组胚胎；同时采用未加已知肾毒性化合物的培养水在相同条件下培养，制得正常组胚胎；将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含同一已知肾毒性化合物和待测化合物的培养水溶液中，培养20～28h，然后去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，制得治疗组胚胎；

或者：

将发育3～6天的斑马鱼胚胎放入含已知肾毒性化合物的培养水溶液中，培养20～28h，用纯水洗净胚胎表面残留液，然后将胚胎分为两组，一组移入培养水中，另一组移入含有待测化合物的培养水溶液中，将两组胚胎继续培养24h，去除死亡胚胎，用纯水洗净胚胎表面残留液，培养水培养的一组记为损伤组胚胎，含有待测化合物的培养水溶液培养的一组记为治疗组胚胎；采用培养水培养44～52h h，制得正常组胚胎；