[发明专利]一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法

权利要求书

1.一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法，其特征在于，辅助接头为下述a-h中的至少一种：

a为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端；

b为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端；

c为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为粘末端；

d为含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为粘末端；

e为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端；

f为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端；

g为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端；

h为含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，中的辅助接头,引物选自下述(I)-(VI)中的至少一种：

(I)当辅助接头为a和c时，引物设计成互补于经过亚硫酸氢盐翻转处理的辅助接头的序列，且在5’末端额外连接有限制性内切酶的识别位点，所述的限制性内切酶的识别位点位于引物上，并保证该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上下游5bp的范围内；与待测DNA片段连接方式为粘性末端连接;

(II)当辅助接头为b和d时，辅在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游5bp内位置设计酶切位点，该酶切位点需符合以下三个特点：1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG二核苷酸位点；与待测DNA片段连接方式为粘性末端连接;

(III)当辅助接头为e和g时，引物设计成互补于经过亚硫酸氢盐翻转处理的辅助接头的序列，且在5’末端额外连接有限制性内切酶的识别位点，所述的限制性内切酶的识别位点位于引物上，并保证该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上下游5bp的范围内；与待测DNA片段连接方式为“T-A”连接。

当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行单酶切；

(IV)当辅助接头为f和h时，在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游5bp内位置设计酶切位点，该酶切位点需符合以下三个特点：1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG二核苷酸位点；与待测DNA片段连接方式为“T-A”连接；引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切；

(V)辅助接头设计同f、h接头设计，进一步在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游20-30bp内位置设计酶切位点，该酶切位点同时满足以下四点：1）该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2）酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3）该酶切位点不含有CpG二核苷酸位点；4）该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上、下游5bp内；

在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切;

(VI)是(V)和b、d、f、h的组合，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合，该方案可以使用双酶切去除辅助接头;在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行双酶切。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中在（IV）中，在所述引物5’端设计另外一个酶切位点，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合；当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行双酶切。