[发明专利]基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

随着设施农业的发展，温室栽培面积不断扩大，氮素化肥的使用量大幅上升，大大超过了植物的需求量。由于土壤中过量的硝酸盐未能及时被植物吸收并转化，造成大量的盐分离子在土壤中积累，最终形成设施载体土壤次生盐渍化。 

研究表明，设施栽培次生盐渍化土壤中除HCO₃^－外，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^－、SO₄^2－、NO₃^－均有不同程度的积累。研究表明，该类型土壤中的阳离子组成，Na⁺已不是主要离子，阳离子以Ca²⁺为主，其含量约占阳离子总量的60％以上，Mg²⁺含量在15％‐20％；阴离子以NO₃^－和SO₄^2－为主，NO₃^－含量约为阴离子总量的56％‐76％。NO₃^－可在植物体内累积，最终通过食物链进入人体，过量的NO₃^－在体内易被还原成为NO₂^－，NO₂^－可使细胞组织缺氧，严重时使人窒息死亡。因此治理设施栽培中过量的硝态氮已成为设施农业一项重要且刻不容缓的工作。目前针对我国设施栽培大棚盐渍化，已经采取了一些治理措施，如灌水洗盐，土壤改良剂法和半腐熟有机肥法等方法。虽然这些方法有不少成功应用的实例，但也存在较多的不足：灌水洗盐会把硝态氮淋洗到地下，不仅造成土壤氮素的损失，且污染地下水；土壤改良剂法成本比较高，易产生二次污染；半腐熟有机肥法则存在肥效慢，使用不便等缺点。 

与传统治理次生盐渍化方法相比，生物法尤其是生物酶法有许多突出优点，比如见效快、能耗低、不会给周边环境带来负担。然而，硝酸盐还原酶在微生物体内的表达量普遍很低，且多为胞内表达，因此应用的范围和效果十分有限，不能满足修复环境的需求。于是构建一种高效的硝酸盐还原酶表达载体及工程菌株，对实现硝酸盐还原酶的高效表达及设施栽培盐渍化土壤的快速修复就尤为关键。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的由于硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法，能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，对于次生盐渍化土壤的快速修复乃至实现精准农业具有重大意义。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种硝酸盐还原酶的工程菌，该工程菌为外源表达硝酸盐还原酶的大肠杆菌。 

所述的硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1硝酸盐还原酶编码基因，由硝酸盐还原酶催化亚基SG‐NA和电子转移亚基SG‐NB构成，其核苷酸序列分别为2394bp和2127bp，分别编码797和708个氨基酸。 

所述的硝酸盐还原酶催化亚基SG‐NA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；硝酸盐还原酶电子转移亚基SG‐NB的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。 

所述的硝酸盐还原酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。 

所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。