[发明专利]一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法

权利要求书

1.一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）取棉花种子，诱导萌发；

（2）取步骤（1）中萌发3~4周后的棉花真叶，漂洗干净，撕取表皮条，将收集的表皮条转入酶解液中，于23~28℃水浴震荡1.5~2h游离保卫细胞原生质体；

（3）向步骤（2）中酶解结束后的混合液中加入混合液5~10倍体积的基本介质，滤网双层过滤，滤液低速离心，弃上清液，保留离心管管体下端1/3的溶液，所述低速离心为200~300转/min，离心5~8分钟；

（4）将步骤（3）中保留溶液加入基本介质重新悬浮，高速离心，弃上清，所述高速离心为700~800转/min，离心8~10min；重复此步骤2~3次，可获得纯净的原生质体；

步骤（3）、步骤（4）中所述基本介质为液体，其组成为：谷氨酸钾10 mmol/ L、MgCl₂ 2 mmol/ L、 Mes 10 mmol/ L，山梨醇调渗透压至550~600 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调pH至5.0~6.0。

2.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（2）中所述酶解液体系组成为：纤维素酶RS 1.3wt%、果胶酶Y-23 0.03wt%、牛血清蛋白BSA 0.25wt%、抗坏血酸 0.5 mmol/L，山梨醇调渗透压至530~550 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调节pH至5.0~6.0。

3.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（1）中诱导棉花种子萌发的具体步骤为：取成熟饱满的棉花种子，80℃水浴浸种2分钟；浸种后，棉花种子在16 h光照/8 h黑暗、光强为22 KLux、温度20~29℃、相对湿度60%至70%的条件下诱导萌发。

4.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（3）中滤网为400目。