[发明专利]一种制备紫花白及原生质体的方法及其专用试剂

权利要求书

1.一种制备紫花白及原生质体的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；

（1）原生质体的分离：选取紫花白及组培再生苗或野生植株大而饱满的叶片，在超净工作台中将其横向切割为1mm的片段，放入60mm培养皿中，将酶溶液A倒入培养皿里，用镊子将所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值为5.7，根据材料的多少来决定酶溶液A的使用量，酶溶液A与材料比例为10ml:1g，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上黑暗处理4 h，震荡条件为26-28℃、120rpm，即终止酶解，此时原生质体已充分分离出来，用吸头轻轻吹打叶片，以释放出全部原生质体，获得原生质体酶溶液；

（2）原生质体的纯化：将原生质体酶溶液用200目的细胞筛过滤，再将滤液置于2ml离心管中，在100g/min下离心3min，使原生质体沉降，然后弃上清夜，将沉降物缓慢加入酶溶液B中，在100 g/min的转速下离心3-5次，每次3min，最终得到纯化的原生质体；

（3）原生质体产量的测定：将纯化的原生质体转入2ml酶溶液B中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示（个/g）；

（4）原生质体活力率的测定：利用FDA（荧光素双醋酸酯）透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力；计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。

2.根据权利要求1所述的制备紫花白及原生质体的方法，其特征是：所述培养皿为直径60 mm、高15 mm的玻璃培养皿。

3.一种用于权利要求1所述的制备紫花白及原生质体的方法的专用试剂，包括酶溶液A和酶溶液B；

所述酶溶液A配比如下：

成分加入量

MES                       1.0ml（200 mmol）

KCl                       2.5ml（80 mmol）   

Mannitol 5.0ml（0.8 mol）

Cellulase R10 150.0mg

Pectolyase Y-23  50.0mg

BSA   1.0ml（10 mg）

CaCl₂ 400.0ul（250 mmol）

ddH₂O 100.0ul

所述酶溶液A中成分浓度为：Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032 mol/ml，CaCl₂ 0.625 mol/ml；

所述酶溶液B配比如下：

成分  加入量

MES   1.0ml（200 mmol）

KCl   2.5ml（80 mmol）

Mannitol 5.0ml（0.8 mol）

BSA   1.0ml（10 mg）

CaCl₂ 400.0ul（250 mmol）

ddH₂O 100.0ul

所述酶溶液B中成分浓度为：Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032 mol/ml，CaCl₂ 0.625 mol/ml。