[发明专利]一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法

说明书

本发明涉及了一种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮效率的快速评估方法。主要步骤为：一)植物‑根瘤菌转录本信息共提取；二)固氮酶表达原位检测；三)以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力。本发明的优势在于：(1)操作步骤简单、方便；(2)可用于田间快速、实时检测固氮水平。

技术领域

本发明涉及一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法。

背景技术

大气中氮气的比例占79％，但是所有的动植物以及大多数微生物都不能利用分子态氮作为氮源，而所有的生命都需要氮。生物固氮是指微生物将氮还原为氨的过程。据联合国粮农组织(FAO)1995年的粗略估计，全球每年由生物固氮作用固定的氮量接近2×10⁶吨，占全球植物需氮量的约3/4。根据固氮微生物与高等植物以及其他生物的关系，可以分为三大类：自生固氮体系、共生固氮体系和联合固氮体系。共生固氮是自然界最主要的固氮体系，包括根瘤菌与豆科植物、弗兰克氏菌与非豆科植物、固氮蓝细菌与植物以及蓝细菌与真菌的共生体地衣等，其中根瘤菌与豆科植物的共生固氮最为突出。根瘤菌共生固氮是在豆科植物根瘤共生组织中进行的生理过程，根瘤的固氮活性和固氮效率将直接决定了豆科植物的生理特征。

豆科植物是我国重要的经济作物。以大豆为例，大豆生长过程中，大豆植物与大豆根瘤菌形成的固氮共生体是大豆氮源的主要摄取途径，大豆根瘤固氮共生体固氮能力的强弱直接影响着大豆的产量和品质，对大豆种植有着非常重要的指导意义。在此过程中，对大豆根瘤固氮共生体中根瘤菌编码的固氮酶活性的检测，是评估其固氮能力的基础指标。但由于固氮酶本身不易提取且容易失活，另外受限于根瘤菌的生理特性，编码固氮酶的相关基因仅在共生状态下进行表达，因此目前对于固氮效率的检测多采用间接方法。

目前，¹⁵N同位素稀释法是确定豆科植物和根瘤菌固氮共生体固氮能力的常用方法，该方法检测指标直接，但检测周期长，并且需要提前施用同位素，所以不能用于田间检测，也不能做到实时检测。因此，实际农业产生需要一种能够快速低成本评估大豆根瘤固氮共生体固氮能力的方法。

发明内容

本发明提供一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮效率的快速、实时评估豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的方法。

nifH基因是根瘤菌固氮酶的结构基因，存在于nif基因簇，其编码产物是固氮酶的结构组分，nif基因是固氮的关键基因。

本发明通过提取根瘤总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA，荧光定量PCR检测利用nifH基因的表达丰度的检测，可以分析不同环境中豆科植物根瘤固氮共生体中固氮酶基因的转录效率，进而间接评估不同实验或田间条件下的豆科植物与根瘤菌的共生固氮效率的变化。

发明内容包括：

一种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的快速评估方法，包括：

一：植物-根瘤菌转录本信息共提取：(1)设定对照组和待测组，对照组和待测组分别由一个或两个以上样本组成，分别提取各样本根瘤总RNA；(2)用分光光度计分别检测各样本中提取的总RNA，得到总RNA的浓度和质量；

二：固氮酶基因转录水平原位检测：(1)分别将对各样本的mRNA反转录成cDNA；(2)分别用荧光定量PCR方法转录各样本的固氮酶nifH基因和参比基因16s，并用2^-ΔΔCt方法计算待测组相对于对照组，固氮酶nifH基因的相对转录丰度；

三：以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力。

所述样本取自一株或两株以上相同品种豆科植物。同组样本中，豆科植物处于相同生长环境下；组间样本中，豆科植物生长环境不同

具体而言包括如下步骤：