[发明专利]一种生产高光学纯度D-苯丙氨酸的方法

权利要求书

1.一种应用固定化苯丙氨酸脱氨酶生产D-苯丙氨酸的方法，其特征在于，以DL-苯丙氨酸溶液为底物，将固定化苯丙氨酸脱氨酶填装入固定床得到固定床酶反应器，催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，得到高光学纯的D-苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反应器是由固定化苯丙氨酸脱氨酶与硅藻土混匀后填充玻璃柱得到。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反应器是将100-200个酶活单位的固定化苯丙氨酸脱氨酶与100-120g的硅藻土充分混合，装进径高比为5:1，体积为450mL的玻璃柱中，固定床酶反应器的温度以循环夹套控制。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述固定化苯丙氨酸脱氨酶主要通过以下步骤获得：(1)MCM-41载体的修饰：以介孔二氧化硅MCM-41为载体，将氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羟基上得到MCM-41-NH₂，提供共价固定的锚定位点；(2)制备MCM-41-NH-GA：取适量的载体MCM-41-NH₂与0.5％戊二醛在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤，洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制备成MCM-41-NH-GA；(3)固定化酶：取适量的MCM-41-NH-GA与酶溶液进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体是将1g MCM-41、50mL无水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用无水甲醇洗涤三次，真空干燥后获得修饰的载体MCM-41-NH₂；所述步骤(2)取1g MCM-41-NH₂载体与0.5％戊二醛在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤三次，洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制成MCM-41-NH-GA。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)取1g MCM-41-NH-GA与50mg的酶活性为3-5U/mg的酶溶液进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。

7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸包括以下步骤：以12mL/min的流速往固定床酶反应器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，温度控制在50℃，当流出的反应液中L-苯丙氨酸转化率达到80％时，调整反应液的pH至5，沉淀产物肉桂酸后再调整至初始pH8.5，将反应液泵入反应器继续反应，直至流出的反应液中D-苯丙氨酸的光学纯度超过99％时，反应结束。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脱氨酶是将苯丙氨酸脱氨酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的基因以pET-28a(+)为表达载体，在E.coli BL21中进行表达得到苯丙氨酸脱氨酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括对酶进行纯化：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为35％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8.7，静置半小时后低温离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为55％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在25mM Tris-HCl pH8.7的缓冲液中并且4℃透析数小时。