[发明专利]一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物细胞保存的技术领域，具体涉及到一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法。

背景技术

人外周血单个核细胞指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等细胞。人外周血单个核细胞是制备细胞因子诱导的CIK细胞的种子细胞，也是诱导生成特定淋巴细胞的种子细胞。在实际临床使用中，通常会在患者健康时提取人外周血单个核细胞进行冻存，在需要时再对其进行诱导扩增，因此冻存前后人外周血单个核细胞的质量和数量直接关系到诱导CIK细胞的周期和细胞质量，这就要求在人外周血单个核细胞冻存的过程中，将细胞的损伤降到最低；使细胞在复苏后有较高的活率；复苏后细胞形态规则，扩增周期短。

现有的人外周血单个核细胞冻存技术主要采用血清、渗透性冷冻保护剂和培养基配制冻存液对细胞进行冻存；或者在冻存保护液中加入羟乙基淀粉，采用这种方法冻存的细胞在回输过程中可能导致过敏性反应，并且在复苏之后细胞的虽然存活率较高但细胞活性较低，主要表现为不规则形态的细胞较多，并且在随后诱导培养杀伤细胞过程中，扩增周期较长。

因此要能够满足实际的需要，在人外周血单个核细胞冻存复苏之后细胞不仅要保证有较高的活率还要有较强的细胞活性，还应尽量缩短随后的CIK细胞诱导扩增周期。

为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，以及使用这种冻存保护剂保存人外周血单个核细胞的方法。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂，由以下组分组成：培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份；人血白蛋白5％～7％；海藻糖0.17molL/～0.23mol/L。

此外，本发明还公开了人外周单个核细胞的保存方法，包括以下步骤：

A、采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞；取血浆配置人血白蛋白，外周血单个核细胞采用磷酸盐缓冲液清洗数次；使用人血白蛋白将清洗后的外周血单个核细胞制成细胞悬液；

B、配置冻存保护剂，取培养基43份～53份；自体血浆30份～40份；二甲基亚砜12份～17份混合均匀，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的终含量质量百分数为5％～7％，海藻糖的终含量为0.17molL/～0.23mol/L；

C、取外周血单个核细胞的细胞悬液，加入等体积的冻存保护剂，混合均匀后于-90℃～-70℃的条件下保存10h～24h，然后转入液氮中保存。

综上所述，本发明具有以下优点：

本发明的公开的冻存保护剂和保存方法，可以使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，缩短CIK细胞诱导扩增的周期。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

采集新鲜的EDTA抗凝人外周血加入淋巴分离管中进行离心处理，分别提取上层的血浆和中层的外周血单个核细胞。取血浆配置人血白蛋白，外周血单个核细胞采用磷酸盐缓冲液清洗数次；使用人血白蛋白将清洗后的外周血单个核细胞制成细胞悬液，采用台盼蓝计数，调整细胞悬液的细胞浓度为6.0×10⁷个/ml。

在细胞悬液中加入冻存保护剂，混合均匀后在低温处保存一段时间，然后转入液氮中保存。在实施过程中，可以将细胞悬液分成多份，每份加入的保护剂成分和剂量可以不相同，同时可以让每份的保存条件保持一定差别，对照验证保存过程和条件对保存效果的影响。冻存保护剂的组分、加入比例以及保存条件如表1。

表1：实施例1～7的具体实施方案

将对照组和实施例1～实施例7的细胞保存液在其对应的保存条件下保存一个月；将冻存的细胞在37℃水温下复苏，待完全熔化后，取少量悬液使用台盼蓝染色计数法计算复苏率和细胞活率，结果如表2。

表2：八个实施例中的细胞复苏率和细胞活率